Міністерство освіти і науки України Кам'янець-Подільський національний університет імені Івана Огієнка І. Д. ГРИГОРЧУК, О. М. ОПТАСЮК БІОТЕХНОЛОГІЯ З ОСНОВАМИ НАНОТЕХНОЛОГІЇ КУРС ЛЕКЦІЙ НАВЧАЛЬНО-МЕТОДИЧНИЙ ПОСІБНИК ЕЛЕКТРОННЕ ВИДАННЯ Кам’янець-Подільський 2024 УДК 60+620.3](075.8) ББК 28.087.1+30.600.3я73 Г83 Рекомендувала вчена рада природничо-економічного факультету Кам’янець-Подільського національного університету імені Івана Огієнка (протокол № 1 від 23 січня 2024 року) РЕЦЕНЗЕНТИ: І. В. Федорчук, кандидат біологічних наук, доцент кафедри біології та екології Кам’янець-Подільського національного університету імені Івана Огієнка; М. І. Козак, кандидат біологічних наук, доцент кафедри біології та екології Кам’янець-Подільського національного університету імені Івана Огієнка; У. І. Недільська, кандидат сільськогосподарських наук, доцент, завідувач кафедри екології і загальнобіологічних дисциплін Закладу вищої освіти «Подільський державний університет». Григорчук І. Д., Оптасюк О. М. Г83 Біотехнологія з основами нанотехнології. Курс лекцій: навчаль- но-методичний посібник [Електронний ресурс]. Кам’янець- Подільський: Кам’янець-Подільський національний університет імені Івана Огієнка, 2024. 148 с. Електронна версія посібника доступна за покликаннями: URL: http://elar.kpnu.edu.ua:8081/xmlui/handle/123456789/7885 Навчально-методичний посібник «Біотехнологія з основами нанотехноло- гії (курс лекцій)» на сучасному рівні викладає основні теми навчальної дисцип- ліни: основні напрями та перспективи біотехнології, культивування тваринних та рослинних клітин і тканин, генна інженерія, технологічна біоенергетика і бі- ологічні процеси переробки мінеральної сировини, біотехнологія та проблеми захисту навколишнього середовища, нанотехнології та нанобіотехнологія тощо. Рекомендовано для здобувачів вищої освіти вищих навчальних закладів ІІІ-ІV рівня акредитації, освітнього рівня «Бакалавр», спеціальностей 091 Біоло- гія, 014 Середня освіта (Біологія та здоров’я людини). УДК 60+620.3](075.8) ББК 28.087.1+30.600.3я73 © Григорчук І. Д., Оптасюк О. М., 2024 ЗМІСТ ПЕРЕДМОВА .................................................................................................................................... 6 ВСТУП. ОСНОВНІ НАПРЯМИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ .................... 7 1. Біотехнологія, її мета та основні завдання, місце в системі біологічних дисциплін ............................................................... 7 2. Етапи становлення біотехнології ....................................................................... 10 3. Основні напрями біотехнології. біотехнологія нових матеріалів ... 14 4. Об’єкти біотехнології і їх біотехнологічні функції .................................... 14 5. Основні складові біотехнологічного процесу .............................................. 16 Контрольні запитання: ......................................................................................................... 17 КУЛЬТУРИ ТВАРИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН ............................................................. 18 1. Культивування клітин. Історія розвитку методу ...................................... 18 2. Використання клітинних культур ...................................................................... 21 3. Використання культури клітин людини ........................................................ 22 4. Основні принципи культивування ..................................................................... 23 5. Умови культивування клітин та поживні середовища ......................... 25 6. Гібридизація тваринних клітин ........................................................................... 29 6.1. Механізм злиття клітин при утворенні гібридних клітин ......... 30 6.2. Гібридома. Моноклональні антитіла ...................................................... 31 Контрольні запитання ........................................................................................................... 33 КУЛЬТУРИ КЛІТИН ВИЩИХ РОСЛИН ............................................................................ 34 1. Значення, напрямки та можливості використання культури ізольованих клітин і тканин рослин ........................................... 34 2. Тотипотентність рослинної клітини ................................................................ 36 3. Культура калусних тканин ..................................................................................... 37 3.1. Особливості калусних клітин ...................................................................... 38 3.2. Морфогенез в калусних тканинах ............................................................ 39 4. Суспензійні культури ................................................................................................. 40 5. Культура окремих ізольованих клітин, або культура поодиноких клітин ........................................................................ 41 3 6. Умови та методи культивування рослинних клітин і тканин in vitro ..................................................................... 43 6.1. Склад поживних середовищ і роль їх окремих компонентів ..... 44 6.2. Стерилізація живильних середовищ ...................................................... 44 6.3. Основні вимоги до умов культивування .............................................. 45 7. Протопласти рослинних клітин як об’єкт біологічного конструювання............................................................ 46 7.1. Способи отримання і культивування протопластів ....................... 46 7.2. Застосування ізольованих протопластів .............................................. 48 7.3. Злиття протопластів (парасексуальна гібридизація) ................... 48 8. Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин ....................... 49 9. Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту ..................... 57 Контрольні запитання ........................................................................................................... 60 ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ ВВЕДЕННЯ В ГЕНЕТИЧНУ ІНЖЕНЕРІЮ МОЖЛИВОСТІ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ ...................................................... 61 1. Поняття генної інженерії ......................................................................................... 61 2. Методи технології рекомбінантних ДНК ........................................................ 63 2.1. Ферменти, що використовуються в генній інженерії ................... 63 2.2. Визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК ..... 64 2.3. Гібридизація як високочутливий метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів ................. 68 2.4. Методи клонування ДНК ............................................................................... 69 2.5. Введення гена в клітину ................................................................................ 72 3. Трансгенні рослини і тварини. Перспективи їх використання .......... 77 3.1. Області застосування генної інженерії рослин ................................. 77 3.2. Комерціалізація трансгенних рослин і біобезпека ......................... 81 3.3. Трансгенні тварини: технології одержання ....................................... 83 3.4. Застосування трансгенних тварин .......................................................... 85 4. Генотерапія ...................................................................................................................... 89 Контрольні запитання ........................................................................................................... 93 ТЕХНОЛОГІЧНА БІОНЕРГЕТИКА І БІОЛОГІЧНІ ПРОЦЕСИ ПЕРЕРОБКИ МІНЕРАЛЬНОЇ СИРОВИНИ ................................................ 94 1. Біотехнологія у вирішенні енергетичних проблем. отримання біогазу, спирту із промислових і сільськогосподарських відходів .... 94 4 1.1. Біометаногенез ................................................................................................... 96 1.2. Отримання спирту ......................................................................................... 101 1.3. Рідкі вуглеводні ............................................................................................... 104 1.4. Біологічне отримання водню .................................................................. 105 2. Біогеотехнологія металів ..................................................................................... 108 3. Використання мікроорганізмів у процесах видобутку корисних копалин .................................................... 110 Контрольні запитання ........................................................................................................ 113 БІОТЕХНОЛОГІЯ ТА ПРОБЛЕМИ ЗАХИСТУ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА ............................................................................... 114 1. Принципи біологічних методів аеробної та анаеробної переробки відходів ................................................................... 114 2. Анаеробні процеси очищення стоків ............................................................. 116 3. Аеробні процеси очищення стоків .................................................................. 117 4. Застосування біотехнологічних методів для очищення газо-повітряних викидів і деградації ксенобіотиків ............................ 123 Контрольні запитання ........................................................................................................ 132 НАНОТЕХНОЛОГІЇ ТА НАНОБІОТЕХНОЛОГІЯ ....................................................... 133 1. Нанотехнологія, основні напрями і завдання нанотехнологій ...... 133 2. Нанобіологія та нанобіотехнологія ................................................................ 136 3. Основні напрямки розвитку нанобіотехнологій ..................................... 137 4. Розвиток нанотехнологій в Україні ................................................................ 139 Контрольні запитання ........................................................................................................ 146 СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ............................................................................. 147 5 ПЕРЕДМОВА Біотехнологія – галузь науки і виробництва, що ґрунтується на ви- користанні біологічних процесів і об’єктів для виробництва економічно важливих речовин і створення високопродуктивних сортів рослин, порід тварин і штамів мікроорганізмів. Навчально-методичний посібник «Біотехнологія з основами наноте- хнології (курс лекцій)» на сучасному рівні викладає основні теми нав- чальної дисципліни: основні напрями та перспективи біотехнології, ку- льтивування тваринних та рослинних клітин і тканин, генна інженерія, технологічна біоенергетика і біологічні процеси переробки мінеральної сировини, біотехнологія та проблеми захисту навколишнього середови- ща, нанотехнології та нанобіотехнологія тощо. Рекомендовано для здобувачів вищої освіти першого (бакалаврсь- кого) рівня, спеціальностей 091 Біологія та біохімія, 014 Середня освіта (Біологія та здоров’я людини). Теоретичний матеріал курсу може бути використаний також вчите- лями та здобувачами освіти закладів загальної середньої освіти в класах з поглибленим вивченнях біологічних дисциплін. Лекційний курс розро- блено відповідно до змісту навчальної програми з «Біотехнологія з основами нанотехнології», з урахуванням того, що здобувачі вищої освіти засвоїли ци- тологію та гістологію з основами ембріології, анатомію людини, фізіоло- гію людини та тварини, біохімію, генетику з основами селекції, молеку- лярну біологію. Запропонований курс лекцій у значній мірі сприятиме покращенню засвоєння здобувачами вищої освіти теоретичного матеріалу та забезпе- чить формування належного рівня їхньої професійної компетентності. 6 ВСТУП. ОСНОВНІ НАПРЯМИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ ПЛАН 1. Біотехнологія, її мета та основні завдання, місце в системі біологічних дисциплін. 2. Етапи становлення біотехнології. 3. Основні напрями біотехнології. Біотехнологія нових матеріалів. 4. Об’єкти біотехнології і їх біотехнологічні функції. 5. Основні складові біотехнологічного процесу. 1. БІОТЕХНОЛОГІЯ, ЇЇ МЕТА ТА ОСНОВНІ ЗАВДАННЯ, МІСЦЕ В СИСТЕМІ БІОЛОГІЧНИХ ДИСЦИПЛІН Біотехнологія як наука є найважливішим розділом сучасної біології, яка, як і фізика, стала в кінці XX cт. одним з провідних пріоритетів в сві- товій науці і економіці. Існує багато визначень поняття «біотехнологія» (від лат. bios – жит- тя, technos – архітектура, мистецтво; logos – наука): Найбільш повним і правильним буде таке визначення біотехнології: Біотехнологія – галузь науки і виробництва, що ґрунтується на ви- користанні біологічних процесів і об’єктів для виробництва економічно важливих речовин і створення високопродуктивних сортів рослин, порід тварин і штамів мікроорганізмів. У буквальному розумінні слова біотехнологія – це «біологія + техно- логія», тобто використання фундаментальних біологічних знань у прак- тичній діяльності, спрямованій на виробництво лікарських препаратів, ферментів, білків, барвників, вітамінів та інших біологічно активних сполук, генетичному конструюванні організмів тощо. Біотехнологія – одна з найдавніших і водночас одна з наймолодших наук і галузей промисловості. 7 Вперше термін «біотехнологія» застосував угорський інженер Карл Ерекі у 1917 році. (для позначення робіт, в яких продукти одержували за допомогою живих організмів). Однак термін «біотехнологія» прижився лише з середини 70-х років ХХ ст., коли біотехнологія пережила своє друге народження у зв’язку з появою генетичної інженерії. Власне становлення біотехнології як самостійної науки розпочалося з 1972 р., коли П. Берг зі співробітниками у США створили першу рекомбінантну молекулу ДНК. Сучасна біотехнологія тісно пов’язана з рядом наукових дисциплін, здійснюючи їх практичне застосування або ж будучи їх основним інстру- ментом. Фундаментом біотехнології є мікробіологія, вірусологія, генети- ка, імунологія, хімічна технологія, біохімія, біофізика, молекулярна біо- логія (рис. 1). Рис. 1. Зв’язок біотехнології з іншими науками Мета і завдання біотехнології: Першочерговими завданнями біотехнології є створення:  нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів для гу- манної і ветеринарної медицини (інтерферонів, інсуліну, гормонів ро- сту людини, моноклональних антитіл, вакцин тощо) для ефективної профілактики, діагностики і лікування людей і тварин;  засобів захисту рослин від хвороб і шкідників; бактеріальних добрив і регуляторів росту рослин; нових високопродуктивних і стійких до не- сприятливих факторів зовнішнього середовища сортів і гібридів сіль- 8 ськогосподарських рослин, одержаних методами генетичної і клітин- ної інженерії;  цінних кормових добавок і біологічно активних речовин (кормового білка, амінокислот, ферментів, вітамінів тощо) для застосування у тваринництві з метою підвищення продуктивності тварин;  нових технологій одержання цінних продуктів для використання у харчовій, хімічній, мікробіологічній та інших галузях промисловості;  безвідходних і екологічно безпечних технологій утилізації і біоконве- рсії сільськогосподарських, промислових, побутових відходів для одержання енергоносіїв (біогазу), високоякісного органічного добри- ва, білкових та вітамінних кормових добавок;  удосконалення і оптимізація апаратури для біотехнологічних проце- сів з метою досягнення максимальних виходів кінцевих продуктів;  підвищення техніко-економічних показників біотехнологічних про- цесів, порівняно з існуючими. На шляху вирішення поставлених завдань біотехнологію чекають немалі труднощі, пов’язані з виключною складністю організації живого. Будь-який біооб’єкт – це цілісна система, в якій не можна змінити жоден з елементів, не змінюючи інших, не можна довільно перекомбінувати їх. Будь-який вплив на об’єкт викликає не тільки бажані, але й побічні ефе- кти. Перебудова геному відразу відбивається на багатьох ознаках органі- зму. Окрім цього, екосистема – це свого роду цілісна система, і зміна од- ного з її компонентів позначається на інших компонентах. Успіхи, досяг- нуті у сфері генетичної і клітинної інженерії на найпростіших біологіч- них системах (прокаріотичних організмах), дають надію на подолання цих труднощів. 9 2. ЕТАПИ СТАНОВЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ Хоча біотехнологія як окрема наука та галузь виробництва вважа- ється наймолодшою з усіх відомих, її формування відбувалося разом з розвитком людського суспільства. Серед етапів розвитку біотехнології можна виділити 4, які широко розкривають сутність становлення цієї науки. Перший період, як і у всіх інших наук – це емпіричний період (від грец. «emperikos» – дослідний) або доісторичний – найдовший (6000 р. до н.е. + 2000 р. н.е.). У цей період відбувається використання методів та способів, які ми зараз відносимо до біотехнологічних:  виготовлення хлібу;  виготовлення пива (виготовляли шумери – перші жителі Месопотамії сучасної території Іраку. Набутий досвід передавався та розповсю- джувався серед ассірійців, вавилонян, єгиптян та індійців);  виготовлення оцту;  отримання медових алкогольних напоїв;  перша дистиляція у виноробстві;  виготовлення горілки з хлібних злаків;  виготовлення шампанського;  отримання кисломолочних продуктів;  отримання квашених овочів та капусти;  силосування кормів. Другий період – етіологічний (від грец. «aitia» – причина). Він три- вав в період 1856-1933 рр. Серед досягнень другого періоду слід виділити:  1856 р. – Г. Мендель відкрив закони домінування ознак та ввів понят- тя одиниці спадковості у вигляді дискретних факторів, які переда- ються від батьків нащадкам, пізніше названих генами.  1859 р. – роботи Луї Пастера:  встановлення мікробної природи бродіння; 10  доказ можливості життя у безкисневих умовах;  виготовлення рідкого поживного середовища.  1869 р. – швейцарський біохімік Йоганн Фрідріх Мішер виділив «нук- леїн» (ДНК) з лейкоцитів.  1881 р. – роботи Р. Коха:  метод культивування бактерій на стерильних шматочках картоплі та на агаризованих середовищах внаслідок чого стало можливим отримання чистих культур з наступним цільовим використанням (бродіння, окислення).  1883 р. – І. Мечников розробив теорію клітинного імунітету.  1892 р. – Д. Івановський відкрив віруси. На цей період припадає зародження капіталізму, тому швидко і ак- тивно розвивається виробництво пресованих дріжджів, ацетону, бутано- лу, лимонної та молочної кислот. У Франції працюють над виготовлен- ням біоустаткування для мікробіологічного очищення стічних вод. Третій період – біотехнічний 1933-1972 рр. Усі прогресивні досягнення того часу найшли своє застосування у біотехнології.  1933 р. – А. Клюйвер та А. Перкін запропонували основні технічні прийоми глибинного культивування пліснявих грибів та методи оці- нки продуктів культивування (опублікували роботу «Методи ви- вчення обміну речовин у пліснявих грибів»). Розпочалося впрова- дження у біотехнологію великомасштабного герметичного облад- нання, яке забезпечує стерильні умови культивування.  1936 р. – сконструйовано та впроваджено у практику біореактор (фе- рментер, апарат-культиватор).  1939-1945 рр. – розвиток промислового обладнання для виробницт- ва антибіотиків.  1943 р. – виготовлення пеніциліну у промислових масштабах.  1939 р. – А. Тізеліус – розробив теорію електрофорезу.  1942 р. – М. Дельбрюк і Т. Андерсон вперше побачили віруси у елект- ронному мікроскопі. 11  1948 р. – народження теля від штучно заплідненої корови.  1949 р. – Дж. Ледерберг відкрив процес кон’югації у Е. соli.  1950 р. – Ж. Моно розробив теоретичні основи безперервного керова- ного культивування мікробів.  1950 р. – відкриття Чаргаффом нуклеотидного складу ДНК.  1951 р. – У. Хейс описав плазміду як позахромосомний фактор спадко- вості.  1953 р. – американський біолог Джеймс Уотсон та британський мо- лекулярний біолог Френсіс Крік визначили структуру подвійної спі- ралі ДНК, що, у свою чергу, призвело до нових відкриттів принципів роботи ДНК на молекулярному рівні.  1959 р. – японські вчені відкрили плазміди антибіотикостійкості (R- фактор) у дизентерійної бактерії.  1960 р. – С. Очоа і А. Корнберг виділили білки-ферменти які можуть «зшивати» нуклеотиди у полімерні ланцюги. Була виділена ДНК- полімераза з кишкової палички.  1961 р. – М. Ніренберг прочитав перші три букви генетичного коду для амінокислоти фенілаланін.  1962 р. – Х. Корана синтезував хімічним способом функціональний ген.  1969 р. – М. Беквіт і С. Шакіро виділили ген lac-оперона у Е.соli.  1970 р. – Виділили фермент рестріктазу. Проте, ці відкриття були досягненнями лише у генетиці, мікробіоло- гії та біохімії і тільки у 1972 році науковці запропонували новаторський підхід об’єднання біохімії з технологіями. У цьому році американці Гер- берт Бойер, Пол Берг і Стенлі Коен розробили рекомбінантну ДНК, яка поєднала ДНК людини та бактерії. Вчені винайшли спосіб перетворення бактерій у «фабрики» з виготовлення таких важливих для людини білків як інсулін та гормон росту. Розпочався четвертий період – генотехнічний (від грец. «genesis» – походження). Цей період характеризується створенням нових методів дослідження:  1975 р. – Г. Келер і Ц. Мільштейн описали метод отримання монок- лональних антитіл (опублікували у журналі «Nature» статтю «Три- 12 валопереживаючі культури гібридних клітин, які секретують антиті- ла певної специфічності»).  1977 р. – М. Максам і У. Гілберт розробили метод аналізу первинної структури ДНК шляхом хімічної деградації, а Дж. Сенгер – шляхом по- лімеразного копіювання з використанням термінуючих аналогів нук- леотидів.  1981 р. – дозволений до використання у США перший діагностичний набір моноклональних антитіл.  1982 р. – надійшов у продаж людський інсулін, отриманий від клітин Е.соli, дозволено застосування рекомбінантних вакцин; розроблені генно-інженерні інтерферони, фактор некротизації пухлин, ін- терлейкін-2, соматотропний гормон людини.  1986 р. – К. Мюлліс розробив метод полімеразноланцюгової реакції.  1988 р. – розпочато широкомасштабне виробництво обладнання та діагностичних наборів для ПЛР.  1997 р. – отримання клону тварини (вівця Доллі) з диференційованої соматичної клітини. Досягнення біотехнології у четвертому періоді:  Розробка інтенсивних процесів (замість екстенсивних) з продуцента- ми антибіотиків, ферментів, амінокислот та вітамінів.  Отримання суперпродуцентів.  Створення різних продуктів на основі генно-інженерних технологій.  Створення організмів, які раніше не існували у природі.  Розробка та впровадження у практику спеціальної апаратури біотех- нологічних систем.  Автоматизація та комп’ютеризація біотехнологічних виробничих процесів при максимальному використанні сировини та мінімально- му використанні енергії. 13 3. ОСНОВНІ НАПРЯМИ БІОТЕХНОЛОГІЇ. БІОТЕХНОЛОГІЯ НОВИХ МАТЕРІАЛІВ Умовно можна виділити наступні основні напрями біотехнології:  біоенергетика – отримання енергії шляхом біотехнологічних процесів;  біогеотехнологія – використання геохімічної діяльності мікрооргані- змів в гірничодобувній промисловості;  біоелектроніка – використання біологічних структур в області елект- роніки;  біотехнологія харчових продуктів (створення нових харчових продук- тів із заданими властивостями, харчових добавок тощо);  захисту навколишнього середовища від забруднення (очищення про- мислових стоків, створення нових матеріалів);  препаратів для сільського господарства (створення бактеріальних добрив, мікробних препаратів інсектицидів, кормових добавок тощо);  препаратів і продуктів для промислового і побутового використання;  лікарських препаратів (антибіотиків);  засобів діагностики і реактивів. 4. ОБ’ЄКТИ БІОТЕХНОЛОГІЇ І ЇХ БІОТЕХНОЛОГІЧНІ ФУНКЦІЇ Об’єкти біотехнології дуже різноманітні й діапазон їх розповсюджу- ється від організованих частин (вірусів) до людини. Біооб’єкти характеризуються такими показниками, як рівень структу- рної організації, здатність до розмноження (або репродукції), наявність або відсутність власного метаболізму при культивуванні у належних умовах. Що стосується характеру біооб’єктів, то під цим слід розуміти їх структурну організацію. В такому випадку біооб’єкти можуть бути моле- кулами (ферменти, імуномодулятори, нуклеозиди, оліго- і поліпептиди тощо), організованими частинами (віруси, фаги), одноклітинними (бак- терії, дріжджі) і багатоклітинними особинами (нитчасті вищі гриби, рос- 14 линні тканини, одношарові культури клітин ссавців), цілими організма- ми рослин і тварин. Біотехнологічні об’єкти знаходяться на різних ступенях організації:  субклітинні структури (віруси, плазміди, ДНК мітохондрій і хлоропла- стів, ядерна ДНК, ферменти);  бактерії і ціанобактерії;  гриби;  водорості;  найпростіші;  культури клітин рослин, тварин та людини;  рослини – нижчі (анабена-азолла) і вищі – ряскові;  генетично модифіковані організми. Більшість об’єктів біотехнології становлять мікроорганізми. Перспективні біологічні об’єкти:  Трансгенні організми, отримані методами генетичної інженерії (біо- логічний об’єкт створюється шляхом змін його генетичної інформації з метою виключити небажані та посилити необхідні якості або на- дати нові).  Культури клітин тварин і рослин (КК є продуцентами інтерферону, вірусних вакцин, моноклональних антитіл, поверхневих антигенів, ан- гіогенних факторів – фактори, що стимулюють утворення кровонос- них судин).  Термофільні мікроорганізми та ферменти (термофільні мікрооргані- зми продукують ферменти, які характеризуються термостабільніс- тю та високою стійкістю до денатурації у порівнянні з мезофільними. До переваг використання термофільних мікроорганізмів та фермен- тів слід віднести:  Збільшення швидкості реакції.  Підвищення розчинності реактивів.  Зменшення мікробного забруднення).  Анаеробні мікроорганізми (при анаеробному культивуванні не потрібна аерація середовища і біохімічні процеси повільні, що спрощує систему те- 15 пловідведення і підвищує теплозбереження. Анаеробні мікроорганізми успішно використовуються для переробки відходів та стоків у біогаз).  Асоціації для перетворення складних субстратів (основні переваги змішаних культур перед монокультурами:  Здатність утилізувати складні, неоднорідні за складом субстрати.  Підвищена здатність до біотрансформації органічних речовин.  Підвищена стійкість до токсичних речовин.  Підвищена стійкість до впливу навколишнього середовища.  Підвищена продуктивність.  Можливий обмін генетичною інформацією між окремими видами угруповання).  Імобілізовані біологічні об’єкти (іммобілізований біологічний об’єкт – це гармонійна система, яка залежить від правильно підібраних об’єкту, носія та способу зв’язування об’єкта з носієм). 5. ОСНОВНІ СКЛАДОВІ БІОТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ Основними компонентами біотехнологічного процесу є біологічний агент, субстрат, сукупність пристроїв для управління процесом і цільо- вий продукт. Перша складова біотехнологічного процесу – біологічний агент або його компоненти, що виконують основну специфічну функцію, друга – субстрат, третя – біореактор (ферментер), який за допомогою засобів керування забезпечує кращі умови для функціонування біологічного агента або його компонентів. Четверта частина пов’язана з очищенням та поділом необхідного продукту або продуктів, отриманих в ході біоте- хнологічного процесу. У більшості технологій, що використовуються в даний час, найбільш стабільною, ефективною і зручною формою біологічного агента є цілий мікроорганізм, тому так багато біотехнологій використовують мікробіо- логічні процеси. На їх основі створена і розвивається мікробіологічна промисловість, основним завданням якої є виробництво необхідних речовин, амінокис- лот (лізину, треоніну, триптофану, глютаміну та ін), вітамінів, ферментів, 16 антибіотиків, біопестицидів для потреб сільського господарства, а також багатьох інших препаратів, що застосовуються в різних галузях народно- го господарства. Мікроорганізми у біотехнологічному процесі можуть зберігати дуже високу швидкість росту, завдяки цьому величезні кількості їх можуть бути отримані при сприятливих умовах в короткий проміжок часу. Для різних процесів проводять селекцію потрібних форм мікроорганізмів з наявних в природі, модифікацію мікроорганізмів за допомогою мутацій або зміною їх за допомогою генетичної інженерії. У багатьох технологіях використову- ється не цілий мікроорганізм, а виділені з нього і очищені ферменти. Субстрати, що використовуються в біотехнології і одержані проду- кти дуже різноманітні. Нерідко продукт одного біотехнологічного проце- су стає субстратом іншого. Прикладом може служити одержання етанолу, який є субстратом в інших біотехнологічних процесах. Третя складова частина біотехнологічного процесу включає всі ас- пекти підтримуючої системи, наприклад біореактор, всередині якого для біологічного агента або його складових частин створюються опти- мальні умови. Тут втілені знання біологів і інженерів, що забезпечують дизайн і приладове оформлення, необхідне для створення і контролю фі- зико-хімічних параметрів, таких як температура, аерація, рН і т.д. Досягнувши по закінченні біотехнологічного процесу бажаного ре- зультату, наприклад накопичення в реакторі біомаси або іншого цільового продукту, в більшості випадків необхідно потрібний продукт відокремити від компонентів, що містяться у водній фазі. Цей четвертий етап біотехно- логічного процесу, названий процесом виділення і очищення цільового продукту, спочатку зводиться до поділу вмісту біореактора на рідку і тве- рду фази з подальшою концентрацією і очищенням потрібного продукту. КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ: 1. Що таке біотехнологія? 2. У чому полягає взаємозв’язок біотехнології з іншими науками? 3. Які основні етапи становлення біотехнології? 4. Які основні напрямки розвитку біотехнології? 5. Перерахуйте основні стадії біотехнологічного виробництва. 6. Які об’єкти біотехнології ви знаєте? 17 КУЛЬТУРИ ТВАРИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН ПЛАН 1. Культивування клітин. Історія розвитку методу. 2. Використання клітинних культур. 3. Використання культури клітин людини. 4. Основні принципи культивування. 5. Умови культивування клітин та поживні середовища. 6. Гібридизація тваринних клітин. 1. КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН. ІСТОРІЯ РОЗВИТКУ МЕТОДУ Культивування клітин – це один з найперспективніших методів у біотехнології. Культивування клітин – процес, за допомогою якого in vitro (поза організмом, дослівно – «на склі») єдина або окремі клітини прокаріот чи еукаріот штучно вирощуються в контрольованих умовах. На практиці термін «культура клітин» відноситься в основному до вирощування клітин, що відносяться до однієї тканини, отриманих від багатоклітинних еукаріот, найчастіше тварин. Історія розвитку методу культивування клітин тварин. Для того щоб вирощувати і розмножувати клітини в культурі (in vitro) необхідно було вирішити ряд практичних завдань: 1. Розробити методику отримання клітин з тканин, що не містять екзо- генних (чужорідних, супутніх) клітин бактерій і грибів. 2. Розробити живильні середовища, в яких виділені з організму клітини могли б продовжувати рости і розмножуватися, тобто в середовищах повинні міститися всі необхідні для клітини живильні речовини і під- тримуватися необхідні фізико-хімічні умови. 18 3. Розробити методики спостереження за клітинами і контролю їх ди- наміки розвитку. 4. Розробити методики тривалого культивування клітин в асептичних умовах. Важливу роль у формуванні теоретичних основ культивування клітин мало і формування концепції гомеостазу Клода Бернара (1813-1878). Суть її зводиться до того, що живі організми здатні зберігати своє внутріш- нє середовище постійним, незважаючи на зміни в навколишньому середо- вищі. Ця концепція поширюється і на рівень клітини: клітина як функціо- нальна одиниця організму здатна підтримувати свій внутрішньоклітинний стан та в певних умовах підтримувати свою життєдіяльність. Для розвитку методу культивування клітин мали значення ряд подій:  У XIX столітті англійський фізіолог С. Рінгер розробив сольовий роз- чин, що містить хлориди натрію, калію, кальцію і магнію для підтри- мки биття серця тварин поза організмом (сьогодні розчин Рінгера (розчин Рінгера-Локка, Рінгера-Тіроде, Кребса-Рінгера.) – це фізіоло- гічний розчин, який за своїм складом близький до плазми крові).  У 1885 році Вільгельм Ру встановив принцип культивування тка- нин – витягував частину кісткового мозку з курячого ембріона і три- мав його в теплому фізіологічному розчині протягом декількох днів.  Дещо пізніше Лоеб (1897 р.) показав, що клітини крові і сполучної тканини можуть виживати в пробірках з сироваткою і плазмою крові, а Льюнгрем (1898 р.) – підтримувати експлантати шкіри людини в життєздатному стані, і вони зберігали здатність до реімплантації.  У 1910 р. Пейтон Раус, працюючи з культурою клітин саркоми курча- ти, індукував утворення пухлин у здорових тварин. Пізніше це приве- ло до відкриття онкогенних вірусів (Нобелівська премія по фізіології або медицині 1966 р.).  Значним етапом у розвитку методів культивування клітин є роботи Алексіса Карреля. Будучи хорошим хірургом, Каррель володів мето- дами асептики, що і дозволило йому домогтися значних результатів з культивування клітин in vitro. Культивування клітин серця курки 19 ним було розпочато 17 січня 1912 р. і тривало 34 роки (за іншими да- ними триває до цих пір). Процедура культивування в лабораторії А. Карреля була дуже складною, і її не змогли відновити в інших лабора- торіях. Для культивування клітин використовувалося модифіковане середовище Рінгера. Методи культивування клітин отримали значний розвиток в 1940- 1950-х роках у зв’язку з дослідженнями в області вірусології. Вирощу- вання вірусів в культурах клітин дало можливість отримання чистого ві- русного матеріалу для виробництва вакцин. Вакцина проти поліомієлі- ту стала одним з перших препаратів масово введених з використанням технології культивування клітин. У 1954 р. Ендерс, Уеллер і Роббінс отримали Нобелівську премію «За відкриття здатності вірусу поліомієлі- ту рости в культурах різних тканин». У 1951 р. була отримана широко відома лінія ракових клітин людини HeLa (HeLa – лінія «безсмертних» ракових клітин, отримана з ракової пу- хлини шийки матки пацієнтки на ім’я Генрієтта Лакс (англ. Henrietta Lacks). Лінія клітин HeLa використовується для дослідження ракових за- хворювань (рис. 2). Рис. 2. HeLa – лінія «безсмертних» ракових клітин В даний час ведуться інтенсивні дослідження біології клітин в куль- турі і, ймовірно, будуть відкриті нові особливості поведінки клітин в ку- льтурі. 20 2. ВИКОРИСТАННЯ КЛІТИННИХ КУЛЬТУР Незважаючи на те, що основним об’єктом біотехнології є мікроорга- нізми, які характеризуються цілим рядом переваг, їх клітини не завжди можуть бути використані в тих чи інших процесах. Цілий ряд білкових продуктів доцільно отримувати в культурі клі- тин тварин. Біомаса культур клітин багата різними біологічно активними речови- нами, і вона може бути використана для отримання цільового продукту: 1. Отримання вірусних вакцин. Перша вакцина, виготовлена на основі культур клітин, була отрима- на в 1954 р. проти поліомієліту американським ученим Солком. В даний час в культурі клітин отримують різні вакцини для людей (проти поліомієліту, кору, паротиту, сказу, краснухи, грипу та ін.) і для сільськогосподарських тварин, та ведуться інтенсивні розробки нових вакцин на основі використання технології рекомбінантних ДНК. 2. Отримання інсектицидів в культурі клітин. Інсектициди можна отримати з вірусів, які летальні для комах пев- ного виду і мають перевагу в тому, що не забруднюють навколишнє се- редовище в порівнянні з хімічними речовинами. 3. Отримання інтерферонів в культурі клітин тварин. Інтерферон – це білок, що синтезується лейкоцитами у відповідь на вплив специфічних чужорідних речовин. Він був відкритий в 1957 р. в клітинах курчати, які були заражені вірусом грипу. Однак подальші дос- лідження інтерферонів показали, що вони можуть синтезуватися не тільки лейкоцитами, але й іншими клітинами ссавців, а у відповідь на ві- русну інфекцію синтезується не один, а ціле сімейство інтерферонів. Ін- терферони інгібують розмноження вірусів у клітині. Інтерферони – видоспецифічні білки, тобто для кожного виду тва- рини характерний свій інтерферон. Однак вони не вірусоспецифічні, тоб- то пригнічують розмноження різних вірусів у клітині. Інтерферони отримують з лейкоцитів крові людини, фібробластів. Лейкоцити виділяють і переносять у культуральне середовище та інфі- 21 кують їх вірусом (Сендай, або вірус Нью-Каслской хвороби), інкубують протягом ночі, після цього лейкоцити осаджують центрифугуванням, ві- рус інактивують. У супернатанті міститься нативний інтерферон. Його висушують і запаюють в скляні ампули. 4. Інші області застосування культур клітин тварин. Ще однією областю використання клітин тварин є використання клітин при випробуванні різних сполук на токсичність, скринінг біологі- чно активних речовин, дослідження механізмів дії ксенобіотиків тощо. 3. ВИКОРИСТАННЯ КУЛЬТУРИ КЛІТИН ЛЮДИНИ Практично будь-які клітини людини можуть бути введені в культу- ру і служити засобом і об’єктом в багатьох медико-біологічних дослі- дженнях. Одна з найважливіших переваг клітин в культурі – можливість при- життєвого спостереження за ними за допомогою мікроскопу. Використання культури клітин людини дає змогу:  рівноцінно замінити клінічні експерименти (експерименти, що вима- гають з’ясування того або іншого питання з використанням 1000 чо- ловік, можуть бути з рівною статистичною достовірністю поставлені на 100 культурах на покривних склах).  розширити дослідження і діагностику різних захворювань, оскільки є можливість оцінки не тільки морфологічних і біохімічних змін, але і змін в поведінці клітин, їх реакції на різні агенти, у тому числі і на лі- карські дії.  тестувати і вивчити механізм дії різних речовин, які можуть бути ви- користані як лікарські препарати, детергенти, косметичні засоби, ін- сектициди, консерванти. Слід зауважити, що результати, отримані на клітинних культурах, не можна екстраполювати на цілий організм, але якщо речовина, що вивча- ється, надає пошкоджуючу дію в декількох лініях культивованих клітин, то слід чекати несприятливого ефекту і на організм людини. 22 4. ОСНОВНІ ПРИНЦИПИ КУЛЬТИВУВАННЯ Відповідно до цілей і завдань експериментальної роботи можна ви- ділити два напрями культивування тваринних клітин:  культури клітин;  культури органів і тканин (органні культури). Список типів клітин, які вже введені в культуру, достатньо ве- ликий:  елементи сполучної тканини людини (фібробласти);  скелетні тканини (кістка і хрящі);  скелетні, серцеві і гладкі м’язи;  епітеліальні тканини (печінка, легені, нирки і ін.);  клітини нервової системи;  ендокринні клітини (надниркові, гіпофіз, клітини острівців Лангер- ганса);  меланоцити і різні пухлинні клітини. Для введення в культуру, залежно від завдань, обирають тканину – дорослу або ембріональну, нормальну чи пухлинну. Культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кра- щим виживанням і активнішим ростом, в порівнянні з відповідними зрі- лими тканинами, оскільки вони містять більше спеціалізованих клітин, що не діляться. Нормальні тканини дають початок культурам з обмеженим часом життя, тоді як культури, отримані з пухлин, здатні проліферувати необ- межено довгий час. Культури клітин, узяті безпосередньо від об’єкту називаються пер- винними. Більшість первинних клітин, за винятком пухлинних, мають обмежений термін використання. Після певної кількості ділень такі клі- тини старіють і припиняють ділитися. Існують іморталізовані («безсмертні») лінії клітин, здатні розмно- жуватися нескінченно. Така властивість характерна в основному пух- линним клітинам. 23 Біотехнологія культур клітин базується на: 1. Здатності виділених з організму клітин рости і розмножуватися поза організмом (in vitro). 2. Можливості змінювати функціональні властивості клітин в культурі завдяки зміні умов культивування або їх часткової генетичної моди- фікації. Однак розробка клітинних технологій, спрямованих на отримання цінних продуктів – метаболітів клітин, стикається з низкою труднощів, обумовлених особливостями поведінки клітин в культурі:  в культурі дуже важко зберегти спеціалізовані властивості клітин, так як після переведення їх в нові умови вони швидко адаптуються і можуть змінювати свої властивості;  в культурі клітини схильні до дегенерації (переродження) та транс- формації (зміна ростових властивостей);  здатні до швидкого старіння, що невигідно для біотехнологічних процесів. Ріст клітин в культурі регулюється різними факторами. Контроль регуляції проліферації може бути представлений як серія послідовних подій, що включають: 1. Вплив різних позаклітинних агентів на рецептори клітинної мембрани. 2. Перенесення інформації від поверхні мембрани за допомогою різних цитоплазматичних переносників. 3. Дія сигнальних молекул на клітинне ядро і ініціацію реплікації. Найімовірніше регуляція проліферації є результатом інтеграції ба- гатьох чинників, що впливають на клітину. Однак закономірності інтег- рації цих факторів залишаються малодослідженими. 24 5. УМОВИ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН ТА ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА Клітини у культурі можна вирощувати:  у вигляді моношару (адгезивному стані);  у суспензії. Культивування клітин у вигляді моношару. Моношар – це культивування клітин на поверхні культурального посуду і у вигляді шару клітин. Ця система культивування фізично і біохімічно найбільш схожа з живими тканинами і має ряд переваг:  дозволяє легко змінювати культуральне середовище, так як клітини прикріплені до поверхні;  отримувати високий рівень експресії клітинних продуктів, так як у клітин прикріплених до субстрату ефективніше експресуються клі- тинні продукти;  забезпечити максимальну гнучкість досліджень, оскільки може вико- ристовуватися для будь-якого типу клітин. Поряд з цим, моношарова культура має і недоліки:  виникають труднощі при збільшенні масштабу культивування;  вимагає великих просторів;  важко визначати динаміку росту клітин;  важко забезпечувати гомогенність клітин. Клітини моношару прикріплюються до поверхні за рахунок електро- статичних взаємодій, тому поверхня культуральних посудин повинна бути змочуваною і негативно зарядженою. Цього можна досягти хімічною обробкою окислюючими агентами або фізичними діями (високовольтним розрядом, ультрафіолетовим сві- тлом, бомбардуванням високоенергетичними електронами). Фірми, що виробляють пластиковий посуд, використовують ці методи. В якості субстрату в даний час використовують декілька матеріалів: 25  зі скла краще за все – пірекс (алюмоборосилікатне скло);  із пластика – полістирол, полікарбонат, полівінілхлорид, тефлон та ін.;  з металу – неіржавіюча сталь і титан. Культивування клітин у суспензії. Суспензійна культура – це вирощування окремих клітин або невели- ких їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з вико- ристанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Харак- терною особливістю суспензійних культур є їх морфологічна та біохіміч- на гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняють- ся за розміром і формою. Існує 2 основних системи культивування клітин: 1. Непроточні культури – тип культур, в якому клітини вводять у фіксований об’єм середовища. У міру росту клітин відбувається викорис- тання живильних речовин і накопичення метаболітів, тому середовище повинно періодично змінюватися, що призводить до зміни клітинного метаболізму. З часом, в результаті виснаження середовища відбувається припинення проліферації клітин. Збільшити тривалість життя непроточних культур можна декілько- ма способами:  переривчастим (частина культури замінюється рівним об’ємом сві- жого середовища);  постійним (об’єм культури збільшується з постійною низькою швид- кістю, а невеликі порції клітин періодично видаляються);  перфузійним (здійснюється постійне надходження свіжого середо- вища в культуру і одночасне видалення рівного об’єму використаного (безклітинного) середовища). Всі системи непроточних культур характеризуються накопиченням відходів в тій або іншій формі і непостійністю зовнішніх умов. 2. Проточні культури забезпечують гомеостатичні умови без зміни концентрації живильних речовин і метаболітів, а також кількості клітин. 26 Гомеостаз обумовлений постійним надхоженням середовища в культуру і одночасним видаленням рівного об’єму середовища з клітинами. Для підтримки нормального функціонування культур клітин періо- дично проводять заміну живильного середовища, пасажирування (від- бір невеликої кількості клітин для вирощування в іншій лабораторній посудині) і трансфекцію (введення невірусним методом чужорідної ДНК для керованої експресії генів) чи трандукцію (введення чужорідної ДНК за допомогою вірусів) клітин. Для культивування клітин необхідні умови, що підтримують їх струк- туру та функціональну активність. Це забезпечують поживні середовища. Поживне середовище повинне максимально відтворити склад при- родного оточення клітини, тобто систему in vivo. На сьогодні повний склад природних середовищ клітин ще до кінця не розшифрований і він досить динамічний, а, отже, їх склад не може бути стандартизований. Поживні середовища для вирощування клітин повинні задово- льняти двом основним вимогам: 1) підтримувати фізико-хімічні умови існування клітин: осмолярність, концентрації іонів водню, необхідний іонний склад і буферну ємність; 2) забезпечувати клітини поживними речовинами, необхідними для си- нтезу органічних речовин (біомаси та продуктів життєдіяльності). Залежно від міри задоволення цим вимогам поживні середовища можуть бути розділені на збалансовані сольові середовища і ростові середовища. Практично всі збалансовані сольові розчини є похідними фізіоло- гічного розчину, який був розроблений Рінгером в 1895 р. До складу роз- чину Рінгера входять три катіона – кальцій, натрій і калій в таких пропо- рціях, в яких вони знаходяться в морській воді або крові вищих тварин. Першим збалансованим сольовим розчином, призначеним для клітин ссавців, був розчин Тіролі. В даний час найбільш широко використову- ються середовища Ерла [Earle W., 1934], Хенкса [Hanks I., 1948] і Дуль- бекко та Фогта [Dulbecco R., Fogt М., 1964]. Ростові середовища забезпечуються клітини поживними речови- нами, необхідними для їх росту. 27 Повна оптимізація складу поживних середовищ досить складне за- вдання і повинно вирішуватися окремо для конкретного типу клітин. Це пов’язано з тим, що потреба в компонентах живлення для різних типів клітин різна. Середовища також класифікують як сироваткові і безсироваткові. Сироваткові середовища – на основі сироватки крові – забезпечу- ють ріст клітин ссавців в системі in vitro. Найоптимальнішим є застосу- вання телячої ембріональної сироватки, оскільки вона характеризується високими ростовими параметрами. Сьогодні встановлено цілий ряд її функцій в рості клітин:  Зв’язує і нейтралізує токсини.  Інактивує протеази середовища.  Постачає гормони і пептидні фактори росту.  Забезпечує клітину поживними речовинами.  Створює буферну ємність.  Сприяє прикріпленню клітин до субстрату.  Захищає клітинні культури.  Є джерелом транспортних білків, які переносять низькомолекулярні речовини. Використання сироватки в поживних середовищах створює і цілий ряд серйозних проблем: не завжди відомий її склад, велика вартість, є джерелом контамінації (інфікування вірусами, бактеріями, грибами), не- можливість контролю складу середовища. Безсироваткові середовища. Використання безсироваткових середовищ дозволяє:  покращити відтворюваність експериментальних результатів і забез- печити стабільну продуктивність культур;  значно знизити ймовірність зараження культури вірусами або мікоп- лазмами;  забезпечити відносно просту систему очистки продуктів метаболізму клітин. Поряд з цими важливими перевагами, безсироваткові середовища мають і недоліки: 28  необхідне додавання в ці середовища гормонів і факторів росту, що робить їх такими ж вартісними, як і середовища з сироватками.  можуть використовуватися лише для окремих типів клітин, тобто не є універсальними. 6. ГІБРИДИЗАЦІЯ ТВАРИННИХ КЛІТИН Припущення про те, що соматичні клітини можуть зливатися один з одним, було висловлене ще в початку ХIX століття у зв’язку з відкриття багатоядерних клітин. Нормальні клітини в природних умовах украй рідко зливаються один з одним. Виняток становить процес запліднення. Крім того, як подібний рід виключення виступає процес плазмогамії у вищих грибів, коли одноядерні гаплоїдні клітини зливаються, утворюючи двохядерні (дикаріони). У ссав- ців, наприклад, клітини можуть зливатися при формуванні м’язових трубо- чок. Звичайним явищем є злиття пухлинних клітин in vivo. При цьому пух- линні клітини іноді зливаються і з нормальними. Гібридизація широко використовується в генетиці, біології клітини, біології розвитку, вірусології, біології пухлин та інших галузях біо- логічної науки, а також на практиці. Гібриди соматичних клітин були відкриті лише в 60-х роках ХХ сто- річчя. У 1960 р. Панський із співробітниками повідомили про виділення лінії гібридних клітин. Гібридні клітини були отримані шляхом змішу- вання двох ліній, виділених раніше з 1 клітини мишачої саркоми. Пізніше було встановлено, що клітинні гібриди можна отримати, використовую- чи клітини різних видів тварин. Як агент, що індукує злиття виступав ін- активований вірус HVJ, званий також вірусом Сендай. З цих пір вірус Сен- дай почав широко використовуватися в експериментах зі злиття клітин. Розрізняють наступні гібридні клітини:  Типові гібридні клітини: Гетерокаріон – це гібридна клітина, яка містить у своїй цитоплазмі два або декілька різних чи однакових ядер. Гетерокаріони не діляться. 29 Синкаріон – це гібридна клітина, в якій відбулося об’єднання хромо- сом різних клітин в одне ядро.  Особливі типи гібридних клітин: Гібридна клітина, що включає в себе каріопласт (ядро, оточене то- нким шаром цитоплазми) + цитопласт (безядерна цитоплазма); Гібридна клітина, що включає в себе цілу клітину + цитопласт; Каріобрид – гібридна клітина, що включає в себе цілу клітину + ка- ріопласт. 6.1. Механізм злиття клітин при утворенні гібридних клітин Для індукції злиття клітин використовуються речовини різної при- роди. Це іони Са2+, поліетиленгліколь, лізолецитин, моноолеат гліцерину, вірус Сендай:  Лізолецитин – поверхнево-активна речовина ліпідної природи, про- дукт деградації лецитину шляхом обробки останнього фосфоліпазою. Лізолецитин ушкоджує мембрани і токсичний для живих систем. Ци- тотоксичний ефект цієї речовини можна зменшити, знижуючи його концентрацію або, додаючи під час обробки альбумін.  Моноолеат гліцерину також сполука ліпідної природи, але його пошко- джуюча дія менш виражена, а частота злиття клітин при застосуванні цієї речовини зростає в 4-7 разів, у порівнянні із спонтанним процесом.  Вірус Сендай – характеризується повною відсутністю цитотоксичного ефекту. Перед використанням його інактивують, опромінюючи ульт- рафіолетовою лампою протягом 5 хвилин, при цьому він втрачає зда- тність до розмноження, але зберігає здатність зливати клітини. Одна цей метод сьогодні майже не використовується.  Використання поліетиленгліколю (ПЕГ) – стандартний спосіб, який застосовується при злитті клітин тварин та рослин між собою та один з одним.  Злиття клітин з використанням лазерного та нейтронного опромі- нення. 30  Електрозлиття – клітини попередньо зближені між собою, піддають впливу електричного поля; спочатку проходить об’єднання мембран, потім цитоплазми і нарешті гібридної клітини. 6.2. Гібридома. Моноклональні антитіла Злиття соматичних клітин лежить і в основі отримання гібридних клітин, що продукують антитіла. Антитіла – білки сироватки крові, які синтезуються в організмі як прояв захисної реакції при попаданні в нього чужорідної речовини (ан- тигена). Імунна система виробляє специфічні антитіла на величезну кіль- кість антигенів (клітини мікроорганізмів, віруси, білки, нуклеїнові кис- лоти тощо. Отримання антитіл для потреб людини до певного виду ан- тигену – одна з найбільш складних завдань медицини та біотехнології. Згідно клонально-селекційної теорії кожен тип антитіл синтезуєть- ся і секретується в кровотоці окремим клоном В-лімфоцитів, тобто в ко- жному В-лімфоциті синтезується тільки один тип антитіл. Виходячи з цього випливає, що якщо виділити В-лімфоцит, перевести його в культу- ру і отримати клон, то отриманий клон клітин буде продукувати одно- типні антитіла, які називають моноклональні. Однак проблема в тому, що виділені лімфоцити в культурі не діляться. Вирішення проблеми було запропоноване в 1975 році англійськими ученими Георгом Келером і Цезарем Мільштейном. Їх заслуга полягає в тому, що вони розробили технологію, яка дозволила здійснювати отримання клонів В-лімфоцитів у культурі і продукувати моноклональні антитіла. Авторам вдалося досягти цього, використовуючи метод гібри- дизації соматичних клітин – В-лімфоцитів і клітин мієломи. Гібридна клітина між спеціалізованою В-клітиною і пухлинною міє- ломною клітиною, отримала назву гібридоми. Гібридома в умовах куль- тури здатна до проліферації і продукції моноклональних антитіл. Цей те- хнологічний напрямок отримав назву гібридомної технології і сприяв інтенсивному розвитку імунобіотехнології. 31 Гібридомна технологія здійснюється у кілька етапів або стадій: 1) імунізація тварин; 2) виділення В-лімфоцитів з селезінки; 3) культивування клітин мієломи; 4) злиття В-лімфоцитів і мієломних клітин; 5) культивування гібридомних клітин; 6) скринінг клонів, які продукують моноклональні антитіла; 7) розмноження гібридоми in vitro (a) чи in vivo (b); 8) продукування моноклональних антитіл гібридомою. Застосування моноклональних антитіл: 1. Найширше використовуються моноклональні антитіла в медичній ді- агностиці. Розроблені системи діагностики, що дозволяють виявити в організмі патологічні зміни, хворі органи тощо (МКА приєднуються до уражених хворобою клітин організму, а відповідні індикаторні ма- теріали дозволяють з’ясувати їх місцезнаходження). Так, у Англії вда- лось отримати антитіла, які специфічно «впізнають» злоякісні пухли- ни товстої та прямої кишки. 2. За допомогою біосенсорів, сконструйованих на основі моноАТ, діагно- стують вагітність, виявляють схильність до діабету, ревматоїдного артриту, спадкових захворювань. 3. За допомогою моноАТ, у формі іммунотоксинів (комплексів монокло- нальних антитіл з отрутами білкової природи, таких як дифтерійний токсин, рицин тощо) можна здійснювати лікування метастазуючих пухлин. 4. МКА використовуються в процесах очищення речовин. Сучасні техно- логії засновані на приєднанні антитіл до твердої матриці носія. До них додають суміш молекул, що містить шуканий антиген. Потім комплекси антиген – антитіло відмиваються від домішок, не пов’язаних з матрицею. Після руйнування ковалентних зв’язків анти- ген-антитіло в розчині залишаються вільні антигени. 5. Завдяки високий специфічності МКА широко використовуються як зонди для точного визначення природи молекул поверхні клітин і клітинної органели. З їх допомогою також можна проводити детекцію активності ферментів. 32 6. Методи імуноферментного аналізу застосовують в діагностиці вірус- них захворювань рослин. Це дозволяє скоротити час отримання без- вірусного посадкового матеріалу, відбирати нові вірусостійкі сорти. 7. За допомогою моноАТ можливе виділення біологічно активних речо- вин (білків, гормонів, токсинів) зі складних сумішей. 8. МоноАТ здатні також нейтралізувати дію лімфоцитів, що відповіда- ють за відторгнення трансплантанту, а також аутоантитіл, які утво- рюються при аутоімунних захворюваннях (деякі форми діабету, роз- сіяний склероз, ревматичні хвороби). 9. В поєднаннях з лікарськими препаратами вони можуть значно поси- лювати ефективність дії останніх на клітини-мішені, дозволяючи при цьому уникати серйозних побічних явищ, які як правило супрово- джують хіміотерапію раку. КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Основні відкриття вагомі для розвитку методу культури клітин тва- рин. 2. Назвіть області використання клітинних культур. 3. Які клітини та тканини людини введені в культуру? 4. Які основні принципи культивування? 5. Умови культивування клітин. 6. Що таке проточні та непроточні культури? 7. Вимоги до поживних середовищ. 8. Як класифікують поживні середовища? 9. Що таке гібридизація тваринних клітин? 10. Які є механізми злиття клітин при утворенні гібридних клітин? 11. Що таке гібридома? Де застосовують моноклональні антитіла? 33 КУЛЬТУРИ КЛІТИН ВИЩИХ РОСЛИН ПЛАН 1. Значення, напрямки та можливості використання культури ізольова- них клітин і тканин рослин. 2. Тотипотентність рослинної клітини. 3. Культура калусних тканин. 4. Суспензійні культури. 5. Культура окремих ізольованих клітин, або культура поодиноких клітин. 6. Умови та методи культивування тканин in vitro. 7. Протопласти рослинних клітин як об’єкт біологічного конструювання. 8. Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин. 9. Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту. 1. ЗНАЧЕННЯ, НАПРЯМКИ ТА МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ КУЛЬТУРИ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН РОСЛИН Клітини і тканини вищих рослин, що вирощуються поза організмом на штучних поживних середовищах в строго контрольованих умовах до- зволяють вивчати ріст, клітинне диференціювання і розвиток рослинно- го організму, розробляти нові клітинні технології для промисловості і сільського господарства. Культури ізольованих клітин і тканин рослин дозволяють вирішу- вати такі глобальні проблеми, як забезпечення населення продовольст- вом, більш ефективну медицина, оптимальну екологія. Культура клітин і тканин рослин може використовуватися в двох основних напрямках: 1) розмноження або підтримання життя у незмінених, у порівнянні з донорами, клітин, тканин, рослин; 34 2) цілеспрямований вплив на зміну генетичного статусу клітин і відбір в селективних умовах потрібних варіантів. Можливості культури ізольованих клітин і тканин рослин ве- личезні:  отримання вторинних метаболітів, що продукуються окремими клі- тинами і тканинами деяких корисних рослин (алкалоїдів, глюкозидів, стероїдів і т.д.), що використовуються для виробництва ліків;  клітинна і тканинна селекція форм з корисними господарськими вла- стивостями;  генетичне поліпшення сільськогосподарських рослин;  прискорене отримання цінних та унікальних генотипів (мікророзм- ноження) і підтримання життєздатності ослаблених клітин і тканин;  звільнення (оздоровлення) посадкового матеріалу від вірусної інфекції;  збереження генофонду в умовах кріоконсервації. З використанням методів культивування також вирішується велика кількість теоретичних проблем, у тому числі:  особливості старіння рослинної клітини;  процеси цитодиференціації і морфогенезу;  роль фітогормонів, вуглеводів, вітамінів, мінеральних речовин при калусогенезі, органогенезі, морфогенезі;  взаємодія клітин вищих рослин з бульбочковими бактеріями і міко- ризними грибами;  механізми стійкості рослин до несприятливих факторів середовища: абіотичних (засолення, кисле середовище, низькі температури і т.д.) та біотичних (патогенів різного походження, що викликають хвороби рослин);  регуляція вторинного обміну;  механізми пухлиноутворення;  популяційні взаємодії в клітинній культурі. 35 2. ТОТИПОТЕНТНІСТЬ РОСЛИННОЇ КЛІТИНИ У основі культивування рослинних клітин лежить властивість тотипо- тентності, завдяки якій соматичні клітини рослини здатні повністю реалі- зувати спадкову інформацію, тобто забезпечити розвиток всієї рослини. Тотипотентність (лат. Totus – весь, potentia – сила) – це властивість клітини реалізувати генетичну інформацію, що забезпечує її диференці- ювання і розвиток до цілого організму. Тотипотентністю характеризу- ються запліднені яйцеклітини рослинних і тваринних організмів. У вищих тварин з ранніх етапів ембріогенезу, з початком спеціаліза- ції клітин, тотипотентність не реалізується. Однак клітини, ізольовані з ембріонів ссавців, в умовах культивування можуть зберігати плюріпо- тентність – здатність диференціюватися в усі типи клітин як власне за- родка, так і екстраембріональних тканин. Такі клітини отримали назву ембріональних стовбурових клітин. У рослин в природних умовах (in vivo) тотипотентність можуть про- являти і спеціалізовані клітини. Приклад тому – вегетативне розмно- ження, в тому числі те, яке спостерігається в результаті розвитку рослин з клітин листя бегонії, фіалки або каланхое. Тотипотентність у рослин реалізується і при загоєнні ран. У цьому випадку на поверхні рани рослин в результаті неорганізованої проліфе- рації клітин відбувається розвиток калусу (лат. callus – товста шкіра, мо- золь) (рис. 3). Калусом називаються недиференційовані клітини, що ма- ють властивість тотипотентності і здатні давати початок цілій рослині. 36 3. КУЛЬТУРА КАЛУСНИХ ТКАНИН Калусна культура – це неорганізовано проліферуюча тканина, яка виникає з дедиференційованих клітин. Рис. 3. Калус, утворений в культурі незрілих зародків ячменю Є три фази росту клітин: 1 – поділ, 2 – розтягування, 3 – диференці- ювання (потовщення вторинної клітинної оболонки і втрата здатності до поділу). Для того щоб диференційовані клітини знову набули здатність до поділу, необхідно, щоб відбулося їх дедиференціювання, тобто клітини повинні як би повернутися в меристематичних стан. Розмноження дедиференційованих клітин призводить до анархічно- го, неорганізованого росту, в результаті чого утворюється калусна тка- нина. Тобто перетворення спеціалізованої клітини в калусну пов’язано з індукцією клітинного поділу, здатність до якого вона втратила в процесі диференціювання. Як правило, для індукції калусних тканин необхідна присутність двох гормонів: ауксинів (дедиференціювання і підготовка до поділу) і цитокінінів (проліферація – поділ). Перехід клітини в пробірці з диференційованого стану до дедифере- нціювання і активного поділу зумовлений зміною активності генів. 37 3.1. Особливості калусних клітин Калусні клітини мають як спільні, так і відмінні риси з нормальними клітинами. Подібні властивості калусних і нормальних клітин:  Синтез вторинних метаболітів.  Морозо- та жаростійкість, стійкість до низьких і високих температур.  Фотоперіодична реакція (зберігається активність фітохромому).  Стійкість до осмотично активних речовин, до засолення і т.п. Відмінності від нормальних клітин:  Зміна складу білків: в калусних клітинах з’являються специфічні біл- ки і одночасно зникають або зменшується кількість білків, характер- них для фотосинтезуючих клітин листка.  Фізіологічна асинхронність, гетерогенність за віком. Присутні молоді клітини в G1-фазі, старі – в G2 і в S-фазах циклу клітинних поділів.  Більш тривалий клітинний цикл, ніж у рослин, які ростуть у відкри- тому грунті.  Необмежений, анархічний ріст.  Слаборозвинуті мітохондрії, як і в меристематичних клітинах (в них мало крист, що впливає на активність аеробного дихання).  Особливості енергетичного обміну. Споживають менше кисню у порі- внянні з нормальними.  Підвищене споживання вуглеводів (в 19 разів), через аеробний гліко- ліз (безкисневе розщеплення вуглеводів у присутності кисню).  Зрушення в обміні вуглеводів в напрямку пентозофосфатного шляху, який є джерелом пентоз, необхідних для діляться клітин. Перераховані особливості калусних клітин дозволяють ефективно використовувати їх в отриманні вторинних метаболітів і селекції рослин. 38 3.2. Морфогенез в калусних тканинах Існує кілька шляхів, якими може піти калусна клітина після її дедиференціювання: 1) вторинна регенерація цілої рослини, можливе диференціювання на рівні клітин, тканин, органів; 2) втрата здатності до вторинного диференціювання і регенерації рос- лин, набуття здатності рости без гормонів (це явище частіше спосте- рігається у старих культур); 3) нормальний онтогенез калусних клітин, що закінчується їх старінням і смертю. Клітина зазнає вторинне диференціювання і припиняє ді- литися (стаціонарна фаза). У культурі калусних тканин виникнення організованих структур з неорганізованої маси клітин називають морфогенезом. Існують різні типи морфогенезу: органогенез – кореневий, стебловий, флоральний, листовий, соматичний ембріогенез (утворення зародкоподібних струк- тур із соматичних клітин) (рис. 4). У разі органогенезу спочатку регене- рують окремі органи, а потім вже з них – цілі рослини, виняток – корене- вий органогенез. а б в г Рис. 4. Морфогенез в калусних тканинах, сформованих в культурі незрілих зародків ячменю (а-в) і пшениці (г): а – ризогенез, б, г – стеблогенез, в – стебло- і ризогенез Вторинне диференціювання калусних клітин не завжди закінчуєть- ся морфогенезом і регенерацією рослин. Іноді це гістодиференціювання. Таким шляхом клітина калуса може перетворюватися у флоемні і ксиле- мні елементи тощо. 39 Для управління морфогенезом використовуються зовнішні і внутрі- шні чинники: внутрішні – вид рослини, генотип, орган, з якого взято екс- плант; зовнішні – склад живильного середовища, температура, світло (інтенсивність, спектр, довжина фотоперіоду). Сигналом (імпульсом) морфогенезу є зміна співвідношення цитокі- нінів і ауксинів, тобто вони не тільки регулятори росту, але і диференці- ювання. Морфогенез починається з того, що під впливом умов середови- ща детермінована клітина відокремлюється від калусних клітин, утво- рюючи потовщену стінку. Від недетермінованих калусних клітин ініціальна клітина відрізня- ється більш великим ядром і меншими розмірами вакуолі. Ядро зазвичай займає центральне положення. В ініціальних клітинах містяться великі кількості крохмалю, іноді ліпідів. Деякий час ініціальна клітина знаходиться в лаг-фазі, що необхідно для перебудови і підготовки до наступних швидких поділів. Потім ці кліти- ни діляться за типом дроблення, утворюючи сферичну масу дрібних ізоді- аметричних клітин. Надалі в меристематичному вогнищі диференціюють- ся зачатки стебла, кореня, листка чи квіткової бруньки і, відповідно, відбу- вається стебловий, кореневий, листовий і флоральний органогенез. 4. СУСПЕНЗІЙНІ КУЛЬТУРИ Суспензійні культури – це одиночні клітини, дрібні, середні і великі агрегати (групи клітин), що вирощуються в рідкому живильному середо- вищі при постійній аерації в асептичних умовах. Суспензії одержують із калусів. Для ініціації суспензійної культури не- обхідно 2-3 г свіжої пухкої маси калусних клітин на 60-100 мл рідкого пожи- вного середовища. Первинну суспензію культивують в колбах з рідким жи- вильним середовищем на кругових качалках зі швидкістю 100-120 об / хв. Основною умовою культивування клітинних суспензій є постійне струшування або перемішування середовища. Інакше знову формується калусна тканина. Поділ підтримується присутністю ауксинів і цитокіні- нів, які необхідні для індукції і росту калусних тканин. 40 Призначення суспензій – отримання вторинних метаболітів (ліків, пар- фумерія, біомаса, селекція і протопласти). Суспензії використовують для отримання важливих хімічних речовин: органічних кислот, ферментів, алка- лоїдів, барвників, білків, амінокислот, які застосовуються у фармакології, парфумерії, харчовій та хімічній промисловості, сільському господарстві. Суспензійні культури мають велике значення для генетики і особ- ливо молекулярної біології: з суспензійних клітин отримують протопла- сти, необхідні для соматичної гібридизації, генетичної інженерії, а також для вивчення метаболізму клітин. 5. КУЛЬТУРА ОКРЕМИХ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН, АБО КУЛЬТУРА ПООДИНОКИХ КЛІТИН Отримання культури окремих ізольованих клітин дуже цінна для ге- нетичних і фізіологічних досліджень, практичного використання в клітин- ній селекції. Так, отримання клону потомства одиночної клітини допомагає встановити причини генетичної неоднорідності калусних клітин. Одиночні клітини виділяють з клітинних суспензій, тканин рослин, з калусних тканин або культури протопластів після відновлення клітинної оболонки. Перші роботи з ізоляції клітин рослин і отримання ізольованих кло- нів було виконано в 1954 р. у Вісконсінському університеті, США. Окремі клітини виділяли з пухкої калусної тканини тютюну, культивованої в рі- дкому живильному середовищі при постійному струшуванні на шейкері. Однак виникали труднощі пов’язані з тим, що окремі клітини не діляться в тих умовах, при яких росте калусна тканина. Однак клони з таких клі- тин вдалося отримати М’юіру зі співавторами з використанням методу тканини-«няньки» (рис. 5). У цьому випадку ізольовану клітину змоче- ну живильним середовищем переносили на фільтрувальний папір, що розміщений поверхні калусної тканини. Калусна тканина індукувала і пі- дтримувала поділ одиночних клітин, а потім і розвиток клітинного кло- ну. У тих же цілях використовують суспензійні культури клітин. 41 Рис. 5. Використання в якості «няньки» культури суспензійних клітин при вирощуванні поодиноких клітин: 1 – колонії клітин; 2 – фільтрувальний папір, 3 – алюмінієва сітка, 4 – пінополіуретан; 5 – суспензія клітин Для індукції клітинних поділів поодиноких клітин можна викорис- товувати «годуючий» шар (клітини суспензійної культури того ж виду рослин, що активно діляться), відділений від культивованих поодиноких клітин напівпроникною мембраною. Пізніше був розроблений метод масового культивування окремих ізольованих клітин – метод плейтінга (від plate – чашка). Метод склада- ється з наступних процедур:  Отримання клітинної суспензії в рідкому живильному середовищі з добре ростучих калусних тканин.  Фільтрування суспензії через сито для видалення великих клітинних агрегатів.  Приготування 0,6-1%-го агарового середовища того ж складу, який був використаний для підтримки росту суспензії.  Нагрівання агарового середовища до рідкого стану і перемішування її з рівною кількістю суспензії, яку необхідно розлити в чашки Петрі шаром близько 1 мм.  Визначення місцеположення окремих клітин з використанням мікро- скопу і нанесення позначок про їх наявність на кришках чашок.  Культивування в темряві при t = 25° С.  Спостереження за розвитком одноклітинних клонів. 42 При даному способі культивування, навіть при недостатньо збалан- сованому складі живильного середовища, може відбуватися розподіл ок- ремих клітин. Це обумовлено тим, що в сусідніх колоніях, утворених з дрібних клітинних агрегатів, синтезуються ростові речовини, які виді- ляються в середовище і стимулюють клітинний поділ. 6. УМОВИ ТА МЕТОДИ КУЛЬТИВУВАННЯ РОСЛИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН IN VITRO Будь-яка тканина рослин – це сукупність клітин, і якщо вона ізольо- вана (виділена) з цілого організму, то позбавлена його регулюючого впливу і харчування. Отже, одним із принципів методу культури тканин (клітин) є відтворення in vitro умов, близьких або ідентичних тим, в яких клітини знаходяться на материнській рослині, для забезпечення їх пов- ноцінного харчування і розвитку. Тоді при строгому дотриманні цих умов в культурі тканин будуть розмножуватися (регенерувати) ідентич- ні вихідному генотипу клітини і рослини. Однак якщо такі умови досягаються і відтворюються не в повній мі- рі, то клітина виявляється у відносно інших фізико-хімічних умовах, що призводить до тимчасової та якісної зміни в реалізації її генетичної ін- формації. Зміщуючи в експерименті тимчасову реалізацію генетичної ін- формації (за допомогою гормональних впливів), можна спостерігати її модифікацію, а під впливом різних екстремальних трансформуючих фак- торів можливо її зміну в потрібному напрямку. Клітина в умовах культури in vitro проявляє цитогенетичну нестій- кість, в результаті цього виникають клітини з генетичною гетерогенніс- тю, з’являються мутанти зі зміненим морфогенезом, які можуть бути ви- хідним матеріалом для селекції. 43 6.1. Склад поживних середовищ і роль їх окремих компонентів Поживні середовища для культивування ізольованих клітин і тка- нин рослин повинні включати всі необхідні неорганічні елементи: мак- роелементи (азот, фосфор, калій, кальцій, магній, сірка), мікроелементи (залізо, бор, марганець, цинк, мідь, молібден і ін.), а також органічні еле- менти: вітаміни, вуглеводи, амінокислоти). Залежно від консистенції існує поділ на рідкі та тверді поживні се- редовища. Для приготування твердих поживних середовищ використовують агар-агар (0,7-1%), який являє собою полісахарид, що одержують з мор- ських водоростей. Агар забезпечує дифузію поживних елементів з сере- довища в культивовані тканини. Крім джерел вуглецю, азоту та інших мінеральних компонентів, сере- довище для культивування тканин рослини, повинне містити специфічні стимулятори і регулятори росту: фітогормони або їх синтетичні аналоги. Відомі три класи фітогормонів, що діють переважно як стимулято- ри (ауксини, гібереліни, цитокініни), і два класи фітогормонів, що мають інгібуючу дію (абсцизова кислота, етилен). 6.2. Стерилізація живильних середовищ Багате поживне середовище – прекрасний субстрат для розвитку в ньому мікроорганізмів. Для знезараження поживних середовищ викорис- товують хімічний вплив (дезінфекція), вплив температури та інших фізич- них факторів (ультразвук, ультрафіолетові промені, ультрафільтрація). У біотехнології широко використовують термічні методи знезара- ження (автоклавування, стерилізацію, кип’ятіння, пастеризацію та ін.). Високі, але короткочасні температурні режими інактивують спори бактерій, надаючи мінімальний вплив на біологічно активні компоненти середовища. У лабораторних умовах стерилізацію поживних середовищ та деяких інших об’єктів проводять в автоклавах парою під тиском, до- тримуючись необхідні режими. В окремих випадках вдаються до сухожа- рові стерилізації. 44 6.3. Основні вимоги до умов культивування Всі маніпуляції з культурою ізольованих тканин рослин проводяться в стерильних умовах. Комплекс заходів, що забезпечують асептику біоте- хнологічних процесів, включає механічний, фізичний та хімічний захист біооб’єкту і середовища його існування, а при необхідності – і кінцевого продукту. Асептика передбачає вологе прибирання приміщень, обробку їх ультрафіолетовими променями, антисептичними засобами, викорис- тання стерильних інструментів, середовищ, технологічного одягу, пода- чу стерильного повітря (столи з ламінарним потоком стерильного повіт- ря в боксованих приміщеннях, надходження в ферментатор стерильного повітря через барботер – (від франц. barbotage – перемішування) та ін. До механічного захисту відносяться видалення механічних домішок, наприклад, з повітря, культиваторів; герметизація устаткування, ізоля- ція вузлів і з’єднань; до фізичного – обробка повітря і поверхонь приладів і апаратів ультрафіолетовими променями, кип’ятіння, стерилізація па- рою під тиском, обробка ультразвуком; до хімічного – обробка робочих поверхонь і біооб’єктів хімічними антисептиками. Культивування ізольованих тканин рослин відбувається на світлі. Освітленість світлової кімнати повинна становити залежно від культури 1000-10000 лк. Необхідно враховувати фотоперіод, який потрібно для даного культивованого об’єкту. Вологість в світловий кімнаті повинна бути 60-70%. Більш сухе по- вітря сприяє всиханню живильного середовища в пробірках і колбах, особливо якщо вони закриті ватними пробками, зміни її концентрації, а значить, і порушення умов культивування. Для підвищення вологості в кімнаті можна використовувати піддони з водою. Оптимальна температура для більшості культивованих тканин – 25-26°С, для культури тканин тропічних рослин – 29-30 °С. У випадку ін- дукції морфогенезу температуру знижують до 18-20 °С. 45 7. ПРОТОПЛАСТИ РОСЛИННИХ КЛІТИН ЯК ОБ’ЄКТ БІОЛОГІЧНОГО КОНСТРУЮВАННЯ 7.1. Способи отримання і культивування протопластів Протопласт – клітина, позбавлена целюлозної оболонки, оточена мембраною цитоплазми, яка зберігає всі властивості, характерні рослин- ній клітині. Вперше протопласти в 1892 р. виділив Дж. Клеркер, який викорис- товував механічний спосіб. При цьому способі у плазмолізованих клітин розрізають клітинну стінку і протопласти виходять в середовище. В да- ний час метод зазнав модифікації, але має ряд недоліків. Інший метод виділення протопластів – ензиматичний, з викорис- танням ферментів. У 1952 році Салтон за допомогою ферменту лізоциму вперше зруйнував клітинну оболонку бактерій. У 1960 році Коккінг об- робив кінчики коріння томату гідролітичним ферментом з культураль- ної рідини цвілевих грибів (Myrothecium verrucaria) і вперше отримав ізо- льовані протопласти вищих рослин ензиматичним способом. Ензиматичний метод в порівнянні з механічним має ряд переваг:  одночасно виділяється велика кількість протопластів (до 10 млн. з 1 гр тканини або клітин);  клітини не піддаються сильному осмотичному стресу;  клітини не ушкоджуються;  метод порівняно швидкий. Для видалення клітинної оболонки використовують ферменти трьох типів: целюлази, геміцелюлази і пектинази. Комбінація ферментів і їх співвідношення специфічне для кожного типу клітин. Виділення протопластів проводять в три етапи:  обробка ферментами;  виділення протопластів з клітинних оболонок;  відділення інтактних протопластів від клітинних осколків. 46 У ізольованих протопластів проблемою стає регуляція водообміну клітини, яка в першу чергу пов’язана з наявністю клітинної оболонки, тому важливого значення набувають осмотичні властивості середовища культивування. Середовище повинне бути злегка гіпертонічним, щоб протопласти знаходилися в плазмолізованому стані. Ці умови гальмують метаболізм і регенерацію клітинної оболонки. В якості осмотичних ста- білізаторів використовують цукри (глюкоза, маніт, сорбіт, ксилоза), іонні осмотики (CaCl2, KCl) в концентрації 0,3-0,8 моль/л. Концентрації підби- раються індивідуально для кожного рослинного об’єкту. Після обробки клітини ферментами їх потрібно відмити від фермен- тів. Відокремити протопласти від ферментативної суміші можна двома способами: або фільтрація з центрифугуванням, або флотація. При фільтрації суміш пропускають через фільтри з розмірами пор 40 мкм. На фільтрі при цьому залишаються грудки клітин і їх великі ула- мки. При подальшому центрифугуванні осідають протопласти, уламки залишаються в супернатанті. При повторному центрифугуванні йде від- мивання від ферменту, після чого протопласти переносяться в середо- вище для культивування. Метод флотації запропонований О. Гамборгом із співробітниками в 1981 році і призначається для ослаблених протопластів. Він заснований на тому, що протопласти мають нижчу щільність, ніж органела або за- лишки клітинних оболонок. До початкової суміші додають розчин саха- рози і центрифугують при швидкості від 40-80 до 350 g. Чисті протопла- сти спливають, а залишки осідають на дно. Далі протопласти культивують в тих же умовах, що і клітини. Склад солей може бути дещо змінений. Середовище складається з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерела вуглецю, азоту, вітамінів, фітогормонів. Відразу після того, як відмиті ферменти, протопласти починають ре- генерувати клітинну оболонку. З’являються целюлозні мікрофібрили, які поступово організовуються в типову клітинну оболонку. Через 2-4 дні протопласти можуть втратити сферичну форму і повністю відновлюєть- ся клітинна оболонка. В залежності від походження протопластів і куль- туральних умов може відзначатися відсутність синтезу клітинної оболо- 47 нки протягом декількох тижнів або місяців. Одним з факторів культура- льного середовища, що обумовлює синтез клітинної оболонки, є сахаро- за. У її відсутності синтез клітинної оболонки не відбувається. 7.2. Застосування ізольованих протопластів Протопласти є унікальною моделлю для вивчення фундаментальних фізіологічних проблем у рослин. Вони незамінні при вивченні складу, структури і функціонування плазмалеми в нормі і при дії на неї гормо- нами, інгібіторами, фітототоксинами, а також при взаємодії самих про- топластів в популяції. Крім того, протопласти можуть використовувати- ся для визначення складу і архітектоніки первинної клітинної оболонки і вивчення механізму її репарації після руйнування. Ізольовані протопласти мають ряд областей застосування, як теоре- тичного, так і прикладного характеру: 1. Вивчення хімічного складу і структури клітинної оболонки (і при руйнуванні, і при синтезі «de novo»). 2. Вивчення властивостей плазмалеми, трансмембранних переміщень. 3. «М’яке» виділення органели. 4. Спостереження за закономірностями диференціювання клітин при злитті протопластів, спостереження взаємодії ядра і цитоплазми в отриманій гібридній клітині, вивчення соматичних гібридів. 5. Введення чужої органели. 6. Введення чужорідних генів в рослинну клітину (трансгенез). 7.3. Злиття протопластів (парасексуальна гібридизація) Ізольовані протопласти, що ще не утворили клітинної оболонки, можуть зливатися між собою. Злиття протопластів – своєрідний метод гібридизації, так звана парасексуальна, або соматична гібридизація. На відміну від звичайної, де зливаються статеві клітини (гамети) при па- расексуальній гібридизації використовуються диплоїдні клітини рослин. Техніка парасексуальної гібридизації може дозволити:  схрещування філогенетично віддалених видів рослин (організмів); 48  отримання асиметричних гібридів, що несуть генний набір одного з батьків разом з декількома хромосомами, органелою або цитоплаз- мою іншого;  злиття трьох і більше клітин;  отримання гібридів, що представляють суму генотипів батьків;  переведення мутацій в гетерозиготний стан, що дозволяє отримувати життєздатні форми при злитті протопластів. 8. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ І ОЗДОРОВЛЕННЯ РОСЛИН У природі існує два способи розмноження рослин: статеве (насіннє- ве) і вегетативне. Більшість видів, зокрема деревні породи, погано розмножуються ве- гетативним способом. Наприклад, не дуже висока ефективність вегета- тивного розмноження дуба, сосни, ялили, горіхоплідних. За допомогою черенкування неможливо розмножувати багато деревних рослин у віці старше 10-15 років. Крім того, розмноження за допомогою щеплень складні і трудомісткі. Досягнення в області культури клітин і тканин призвели до ство- рення принципово нового методу вегетативного розмноження – клона- льного мікророзмноження. Клональне мікророзмноження – отримання in vitro нестатевим шляхом, генетично ідентичних початковому екземпляру рослин. У основі методу лежить унікальна здатність рослинної клітини реалі- зовувати властиву їй тотипотентність. Термін "клон" був запропонований в 1903 році Уебстером (від грецького klon – живець або пагін, придатний для розмноження рослин). Відповідно до наукової термінології клонування має на увазі отримання ідентичних організмів з одиничних клітин. Цей метод має ряд переваг перед існуючими традиційними способа- ми розмноження:  отримання генетично однорідного посадкового матеріалу; 49  звільнення рослин від вірусів за рахунок використання меристемної культури;  високий коефіцієнт розмноження (105-106 – для трав’янистих, квіт- кових рослин, 104-105 – для чагарникових деревних рослин і 104 – для хвойних);  скорочення тривалості селекційного процесу;  прискорення переходу рослин від ювенільної до репродуктивної фази розвитку;  розмноження рослин, що важко розмножуються традиційними спо- собами;  можливість проведення робіт протягом всього року;  можливість автоматизації процесу вирощування. Етапи мікроклонального розмноження рослин: Процес клонального мікророзмноження можна розділити на 4 етапи: 1. Вибір рослини-донора, ізолювання експлантів і отримання стериль- ної культури, яка добре росте. 2. Власне мікророзмноження, коли досягається отримання максималь- ної кількості меристематичних клонів. 3. Вкорінення розмножених пагонів з подальшою адаптацією їх до ґрун- тових умов, а при необхідності депонування рослин-регенерантів при зниженій температурі (+2 оС, +10 оС). 4. Вирощування рослин в умовах теплиці і підготовка їх до реалізації або посадки в полі. Для культивування тканин на кожному з чотирьох етапів потрібне застосування певного складу живильного середовища. На першому етапі необхідно добитися отримання стерильної куль- тури. У тих випадках, коли важко отримати початкову стерильну культу- ру експланта, рекомендується вводити до складу живильного середови- ща антибіотики (тетрациклін, бензилпеніцилін і ін.) в концентрації 100- 200 міліграм/л. Це в першу чергу відноситься до деревних рослин, у яких спостерігається тенденція до накопичення внутрішньої інфекції. На першому етапі, як правило, використовують середовище, що міс- тить мінеральні солі по рецепту Мурасига і Скуга, а також різні біологіч- 50 но активні речовини і стимулятори росту (ауксини, цитокініни) в різних поєднаннях залежно від об’єкту. У тих випадках, коли спостерігається ін- гібування росту первинного експланта, за рахунок виділення ним в жи- вильне середовище токсичних речовин (фенолів, терпенів і інших вто- ринних сполук), зняти його можна, використовуючи антиоксиданти. Це можливо двома способами: або промиванням експланта слабким його розчином протягом 4-24 год, або безпосереднім додаванням в живильне середовище. Як антиоксиданти використовують: аскорбінову кислоту (1 міліграм/л), глутатіон (4-5 міліграм/л), дитіотриетол (1-3 міліграм/л), диетилдитіокарбомат (2-5 міліграм/л), полівінілпіролідон (5000-10000 міліграм/л). В деяких випадках доцільно додавати в живильне середо- вище адсорбент – деревне активоване вугілля в концентрації 0,5- 1%. Тривалість першого етапу може коливатися від 1 до 2 місяців, в резуль- таті якого спостерігається ріст меристематичних тканин і формування первинних пагонів. На другогму етапі необхідно добитися отримання максимальної кі- лькості мериклонів, враховуючи при цьому, що із збільшенням субкуль- тивувань збільшується число рослин-регенерантів з ненормальною морфологією і можливо спостерігати утворення рослин-мутантів. Як і на першому етапі, використовують живильне середовище по ре- цепту Мурасига і Скуга, що містить різні біологічно активні речовини, а також регулятори росту. Основну роль при підборі оптимальних умов культивування експлантів відіграють співвідношення і концентрація внесених до живильного середовища цитокінінів і ауксинів. З цитокіні- нів найчастіше використовують БАП в концентраціях від 1 до 10 міліг- рама/л, а з ауксинівІОК і НОК в концентраціях до 0,5 міліграм/л. При довгому культивуванні рослинних тканин на живильних сере- довищах з підвищеним вмістом цитокінінів (5-10 міліграм/л) відбува- ється поступове накопичення їх в тканинах вище за необхідний фізіоло- гічний рівень, що призводить до появи токсичної дії і формування рос- лин із зміненою морфологією. Разом з тим, можливо спостерігати такі небажані для клонального мікророзмноження ефекти, як пригнічення проліферації пазух меристем, утворення вітрифікованих (оводнених) па- гонів і зменшення здатності рослин до вкорінення. Негативну дію цито- 51 кінінів можливо подолати, за даними Н.В. Катаєвої і Р.Г. Бутенко, шляхом використання живильних середовищ з мінімальною концентрацією ци- токінінів, що забезпечують стабільний коефіцієнт мікророзмноження, або шляхом чергування циклів культивування на середовищах з низьким і високим рівнем фітогормонів. На третьому етапі, як правило, змінюють основний склад середо- вища: зменшують в два, а іноді і в чотири рази концентрацію мінераль- них солей по рецепту Мурасига і Скуга або замінюють її середовищем Уайта, зменшують кількість цукру до 0,5-1% і повністю виключають ци- токініни, залишаючи один лише ауксин. Як стимулятор коренеутворення використовують β-індоліл-3-масляную кислоту (ІМК), ІОК або НОК. Вкорінення мікропагонів проводять двома способами: 1) витримка мікропагонів протягом декількох годин (2-24 год) в стериль- ному концентрованому розчині ауксину (20-50 міліграм/л) і подальше їх культивування на агаризованому середовищі без гормонів або безпо- середньо у відповідному ґрунтовому субстраті (імпульсна обробка); 2) безпосереднє культивування мікропагонів протягом 3-4 тижнів на живильному середовищі, що містить ауксин в невисоких концентра- ціях (1-5 міліграм/л залежно від досліджуваного об’єкту). Останнім часом запропонований метод вкорінення пробірних рослин в умовах гідропоніки. Цей метод дозволяє значно спростити етап вкорінення і одночасно отримувати рослини, адаптовані до природних умов. Для картоплі можливо використовувати безсубстратну гідропоніку для отримання міні-бульб. Затінювання нижньої частини культуральних посудин щільною чорною матерією або додавання в живильне сере- довище активованого вугілля сприяє вкоріненню мікропагонів. Пересадка рослин-регенерантів в субстрат є відповідальним етапом, що завершує процес клонального мікророзмноження. Найбільш сприят- ливий час для пересадки пробірних рослин – весна або початок літа. Рослини з двома-трьома листками і добре розвиненою кореневою системою обережно виймають з колб або пробірок пінцетом з довгими кінцями або спеціальним гачком. Коріння відмивають від залишків агару і висаджують в ґрунтовий субстрат, заздалегідь простерилізований при 52 85-90 °С протягом 1-2 год. Для більшості рослин як субстрати викорис- товують торф, пісок (3:1); торф, дерновий ґрунт, перліт (1:1:1); торф, пі- сок, перліт (1:1:1). Виняток становлять родина орхідних, для яких готу- ють субстрат, що складається з сфагнового моху, суміші торфу, листя бу- ку або дуба, соснової кори (1:1:1). Приготованим заздалегідь ґрунтовим субстратом заповнюють пікі- рувальні ящики або торф’яні горщики, в яких вирощують рослини- регенеранти. Горщики з рослинами поміщають в теплиці з регульованим температурним режимом (20-22 °С), освітленістю не більше 5 тис. лк і вологістю 65-90%. Для кращого росту рослин створюють умови штучно- го туману. У тих випадках, коли немає можливості створити такі умови, горщики з рослинами накривають скляними банками або поліетилено- вими пакетами, які поступово відкривають до повної адаптації рослин. Через 20-30 днів після посадки добре укорінені рослини підгодовують розчинами мінеральних солей Кнудсона, Мурасига і Скуга, Чеснокова, Кно- па (залежно від виду рослин) або комплексним мінеральним добривом. У міру росту рослин їх розсаджують у великі ємності зі свіжим субстратом. Подальше вирощування акліматизованих рослин відповідає прийнятій аг- ротехніці вирощування для кожного індивідуального виду рослин. Процес адаптації пробірних рослин до ґрунтових умов є найбільш дорогою і трудомісткою операцією. Нерідко після пересадки рослин в ґрунт спостерігається зупинка в рості, опадання листя і загибель рослин. Ці явища зв’язані, в першу чергу, з тим, що у пробірних рослин порушена діяльність продихового апарату, унаслідок чого відбувається втрата ве- ликої кількості води. По-друге, у деяких рослин в умовах in vitro не відбу- вається утворення кореневих волосків, що призводить, у свою чергу, до порушення поглинання води і мінеральних солей з ґрунту. Тому доціль- но на третьому або четвертому етапах клонального мікророзмноження застосовувати штучну мікоризацію рослин (для мікотрофних), врахову- ючи їх позитивну роль в постачанні рослин мінеральними і органічними живильними речовинами, водою, біологічно активними речовинами, а також в захисті рослин від патогенів. Індійськими ученими запропонований простий метод запобігання швидкому обезводненню листя рослин, вирощених in vitro, під час їх пере- 53 садки в польові умови. Метод полягає в тому, що листя протягом всього акліматизаційного періоду слід обприскувати 50%-м водним розчином гліцерину або сумішшю парафіну, або жиру в діетиловому ефірі (1:1). За- стосування цього методу допомагає уникнути довгих і скрутних процесів загартовування пробірних рослин і забезпечує 100%- їх приживаність. Методи клонального мікророзмноження. Існує багато методів клонального мікророзмноження, а також різних їх класифікацій. Н.В. Катаєва і Р.Г. Бутенко (1983) виділяють два принципово різних типи клонального мікророзмноження: 1. Активація меристем, що вже існують в рослині (апекс стебла, пазухові і сплячі бруньки стебла). 2. Індукція виникнення бруньок або ембріоїдів de novo:  утворення адвентивних пагонів безпосередньо тканинами екс- планта;  індукція соматичного ембріогенезу;  диференціація адвентивних бруньок в первинній і пересадковій калусній тканині. 1. Активація розвитку меристем, що вже існують в рослині – основний метод, що використовується при клональному мікророзмно- женні рослин. Він заснований на знятті апікального домінування (рис. 6). Цього можна досягти двома шляхами: а) видаленням верхівкової меристеми стебла і подальшим мікрочерен- куванням пагона in vitro на безгормональному середовищі; б) додаванням в живильне середовище речовин цитокінінового типу дії, що індукують розвиток численних пагонів пазух. Як правило, з цито- кінінів використовують 6-бензиламінопурин (БАП) або 6-фур- фуриламінопурин (кінетин) і зеатин. Отримані таким чином пагони відокремлюють від первинного екс- планта і знову самостійно культивують на свіжоприготовленому живи- льному середовищі, що стимулює проліферацію пазух меристем і виник- нення пагонів вищих порядків. 54 В даний час цей метод широко використовується у виробництві по- садочного матеріалу сільськогосподарських культур, як технічних, так і овочевих, а також для розмноження культур промислового квітникарст- ва (наприклад, гвоздики), тропічних і субтропічних рослин, плодових і ягідних культур, деревних рослин. Для деяких культур, таких як картоп- ля, технологія клонального розмноження поставлена на промислову ос- нову. Застосування методу активації розвитку існуючих меристем дозво- ляє отримувати з однієї меристеми картоплі більше 100000 рослин в рік, причому технологія передбачає отримання в пробірках мікробульб – цінного безвірусного насіннєвого матеріалу. Розмноження Рис. 6. Схема розмноження рослин методом активації вже існуючих меристем (по А. Р. Родіну, Е. А. Калашникової, 1993): 1 – шляхом видалення верхівкової меристеми, 2 – додаванням цитокінінів в середовище (б/г – середовище без гормонів, Ц – цитокінін, А – ауксин) 2. Індукція виникнення бруньок або ембріоїдів de novo: Першим з цього методу є – індукція виникнення адвентивних бру- ньок безпосередньо тканинами експланта. Він заснований на здатності ізольованих частин рослини за сприятливих умов живильного середовища відновлювати бракуючі органи і таким чином регенерувати цілі рослини. Можна добитися утворення адвентивних бруньок майже з будь-яких орга- нів і тканин рослини (ізольованого зародка, листка, стебла, сім’ядолей, лу- сочок і дна цибулин, сегментів коріння і зачатків суцвіть). Цей процес від- бувається на живильних середовищах, що містять цитокініни в співвідно- шенні з ауксинами 10:1 або 100:1. З ауксинів використовують ІОК або НОК. 55 У такий спосіб було розмножено багато представників родини лілійних, томати, деревні рослини (із зрілих і незрілих зародків). Другий метод, що практикується при клональному мікророзмно- женні, ґрунтується на диференціації з соматичних клітин зародкоподіб- них структур, які своїм виглядом нагадують зиготичні зародки. Цей ме- тод отримав назву соматичного ембріогенезу. Згідно Стеварду, сома- тичні зародки проходять 3 стадії розвитку: глобулярну, серцеподібну, торпедоподібну і зрештою мають тенденцію розвитку в проросток. Найбільш вражаючим застосуванням методу соматичного ембріогене- зу стало розмноження гвінейської олійної пальми (Elaeis guineensis), масло якої широко використовується при виробництві маргарину і харчового ма- сла. Олійна пальма в природі не утворює пагонів і бічних паростків, що утруднює її вегетативне розмноження. Культивування живців in vitro та- кож неможливе. Було вирішено отримати скупчення клітин недиференці- йованої тканини (калус) шляхом дедиференціювання специфічних тканин, а потім культивувати їх до регенерації цілих проростків. Третій метод клонального мікророзмноження – диференціація ад- вентивних бруньок в первинній і пересадковій калусній тканині. Практично він мало використовується з метою отримання посадко- вого матеріалу in vitro. Це пов’язано з тим, що при частому пасивуванні калусної тканини може змінюватися плоїдність регенерованих рослин, спостерігаються структурні перебудови хромосом і накопичення генних мутацій. Разом з генетичними змінами відмічаються і морфологічні: ни- зькорослість, неправильне жилкування листків, утворення укорочених міжвузлів, знижена стійкість до хвороб і шкідників. В той же час, деякі недоліки цього методу в селекційній роботі обертаються перевагами. Крім того, в деяких випадках він є єдино можливим способом розм- ноження рослин в культурі тканин. Через калусну культуру успішно ро- змножуються цукровий буряк, злакові, представники роду Brassica, со- няшник та інші культури. Основна перевага клонального мікророзмноження – отримання ге- нетично однорідного, безвірусного посадкового матеріалу. Припущення про можливість відсутності вірусів в меристематичних тканинах хворих рослин вперше було висловлене в 1936 р. Чунгом, а пізніше, в 1943 р., і 56 Уайтом. У 1949 р. цей факт був підтверджений експериментально. У 1952 р. Морелю і Мартену з Національного агрономічного інституту (Франція) вдалося отримати безвірусні жоржини із заражених рослин. 9. МЕТОДИ ЗБЕРЕЖЕННЯ ГЕНОФОНДУ. МЕТОДИКА КРІОКОНСЕРВАЦІЇ, СПОСОБИ УПОВІЛЬНЕННЯ РОСТУ При отриманні клітинних ліній з корисними ознаками стає пробле- ма збереження цих ознак. Рослини можуть зберігати генетичну інформа- цію в насінні, проте це джерело не цілком надійне, оскільки з часом через мутації схожість насіння падає. Крім того, деякі рослини розмножуються тільки вегетативно. Цим обумовлена необхідність збереження частини матеріалу in vitro. З іншого боку, в деяких випадках вдається отримати нові клітинні лінії, що синтезують більшу кількість вторинних метаболі- тів, тобто продуктивніші, які теж потребують збереження. Для дослідження фізіологічних і біохімічних процесів, що протіка- ють в тканинах, також потрібні стандартні початкові культури, чим ви- кликана необхідність зберігати матеріал протягом певного проміжку ча- су, коли йдуть серійні експерименти. Все це робить проблему збережен- ня генофонду вельми актуальною. Існують різні підходи до збереження культур:  кріозбереження;  уповільнення росту. Кріозбереження – заморожування матеріалу при наднизьких тем- пературах. Зазвичай його проводять в рідкому азоті, при температурі –196 oC. Успіх низькотемпературної консервації залежить від ряду чинників:  виду і типу клітин;  їх концентрації в суспензії;  складу середовища для консервації;  виду і концентрації кріопротектору; 57  режиму охолоджування і відігрівання;  способу реабілітації клітин після відігрівання. Істотну роль в успішному заморожуванні клітин відіграє їх морфофізі- ологічний стан: клітини, що знаходяться в стаціонарній фазі росту, менш стійкі до пошкоджуючої дії низькотемпературної консервації, ніж клітини, що знаходяться в експоненціальній фазі росту. Клітини для заморожування відбирають в середині експоненціальної фази ростової кривої. Для рослинних клітин часто потрібне попереднє культивування в особливих умовах. В середовище додають різні речовини, наприклад:  2-6% маніт або сорбіт для зменшення розміру вакуолей;  амінокислоти, в першу чергу пролін, який служить для затримки води в клітині, аспарагін, γ-аміномасляну кислоту;  крім того, застосовують штучне загартовування до холоду, коли зни- жують температуру культивування, імітуючи природний осінній процес підготовки до періоду зимового спокою. Клітинні культури витримують декілька діб при температурі +8 – +10oC, а потім при +2 – +5oC протягом 1-6 тижнів. Процес заморожування рослинних клітин від тваринних відрізняє, в основному, наявність етапу попереднього культивування. Кріопротектори – речовини, що дозволяють понизити пошкоджую- чу дію фізико-хімічних чинників при кріоконсервуванні. До них відно- сяться сахароза, декстран, етилгліколь, полівінілпіролідон, диметилсу- льфоксид (ДМСО), гліцерин. Для визначення токсичності кріопротектора клітини витримують при кімнатній температурі в різних його концент- раціях протягом 30-50 хвилин, після чого визначають їх життєздатність. Програми охолоджування можуть бути різними, але для всіх них ха- рактерна повільна швидкість охолоджування. При заморожуванні відбу- вається утворення льоду усередині і зовні клітин. Характер цих змін за- лежить від зразка, що вивчається, і обробки кріопротекторами, але голо- вним чином, від швидкості охолоджування. При повільному охолоджу- ванні відбувається утворення позаклітинного льоду, що приводить до обезводнення клітини до того, як буде досягнута точка замерзання ци- топлазми. При швидкому охолоджуванні клітини швидше заморожують- ся зсередини, повільніше зневоднюються, що призводить до утворення 58 кристалів льоду усередині клітини. В цьому випадку клітини ушкоджу- ються. Звичайне охолоджування проводять в два етапи: 1-й етап: від +20 до -28oC із швидкістю 1 градус в хвилину (для рос- линних клітин швидкість заморожування 0,5 градуси в хвилину до - 35 0С), витримують при цій температурі 15 хвилин. 2-й етап: занурення в рідкий азот (миттєве охолоджування до – 196 0C). Заморожування проводять в спеціальних апаратах. При їх відсутнос- ті – на спиртовій лазні (0,5-1 літр спирту наливають в термос з метале- вою колбою, занурюють в нього ампули на 15 хвилин і додають при по- мішуванні рідкий азот або сухий лід; доводять температуру до -32oC (те- мпература повинна бути не вище -28 і не нижче -32оС). Далі переносять ампули в рідкий азот. При розморожуванні ампули пінцетом переносять у водяну лазню з температурою +37 – +40оС, ампула об’ємом в 1 мл розморожується про- тягом 0,5-1 хвилини. Після розморожування клітини відмивають або в ростовому середо- вищі (тварини), або в підтримуючому середовищі. Рослинні клітини та- кож можна відмивати 3-10% розчином сахарози. Далі клітини перевіряють на життєздатність за допомогою віталь- них фарбників, що забарвлюють мертві клітини. Остаточним критерієм служить чітке відновлення росту на стандартних живильних середови- щах, використовуваних для даної культури. Уповільнення росту можна добитися наступними методами: 1. Зберігання під шаром мінерального масла (для бактерійних і грибних культур). 2. Зміна газового складу і атмосферного тиску усередині культуральної посудини. 3. Зміна світлового режиму. 4. Охолоджування до температури припинення активного росту. 5. Застосування гормональних і осмотичних інгібіторів. З гормональних інгібіторів найчастіше використовують хлорхолінхлорид (для рос- линних клітин), з осмотичних – маніт в концентрації 3-6 . 6. Заміна СaСl2 на Ca(NO3)2 в живильних середовищах. 59 КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Яке значення, напрямки та можливості використання культури клі- тин і тканин рослин? 2. Що таке тотипотентність рослинної клітини? 3. Що таке культура калусних тканин? 4. Які зміни відбуваються у спеціалізований клітині при переході до де- диференціації? 5. Із яких органів рослини можна отримати калусну тканину? 6. Які особливості калусних клітин? 7. Що таке клітинна суспензія та яке її практичне значення? 8. Калусній тканині якого типу надається перевага для отримання клі- тинної суспензії? 9. Що таке культура окремих ізольованих клітин, або культура пооди- ноких клітин? 10. Умови та методи культивування рослинних тканин in vitro. 11. Способи отримання і культивування протопластів. 12. Які області застосування ізольованих протопластів? 13. Що таке мікроклональне розмноження? 14. Назвіть основні переваги мікроклонального розмноження над тради- ційним. 15. Назвіть методи мікроклонального розмноження. 16. Назвіть етапи мікроклонального розмноження рослин. 17. При яких умовах проводять коренеутворення проростків при мікрок- лональному розмноженні суниці? 18. Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин. 19. Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту. 60 ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ ВВЕДЕННЯ В ГЕНЕТИЧНУ ІНЖЕНЕРІЮ МОЖЛИВОСТІ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ ПЛАН 1. Поняття генної інженерії. 2. Методи технології рекомбінантних ДНК. 3. Трансгенні рослини і тварини. Перспективи їх використання. 4. Генотерапія. 1. ПОНЯТТЯ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ Важливою складовою частиною біотехнології є генетична інженерія. Народившись на початку 70-х років, вона добилася сьогодні великих ус- піхів. Методи генної інженерії перетворюють клітини бактерій, дріжджів і ссавців в «фабрики» для масштабного виробництва будь-якої речовини, особливо білка. Це дає можливість детально аналізувати структуру і фу- нкції білків і використовувати їх як лікарські засоби. Генетична інженерія – конструювання in vitro функціонально ак- тивних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), або інакше – ство- рення штучних генетичних програм. Генетична інженерія – система екс- периментальних прийомів, що дозволяють конструювати лабораторним шляхом (у пробірці) штучні генетичні структури у вигляді так званих ре- комбінантних або гібридних молекул ДНК. Під рекомбінантними розу- міють ДНК, утворену об’єднанням in vitro (у пробірці) двох або більше фрагментів ДНК, виділеної з різних біологічних джерел. Генетична інженерія – отримання нових комбінацій генетичного матеріалу шляхом маніпуляцій, що проводяться поза клітиною, з моле- кулами нуклеїнових кислот і перенесення створених конструкцій генів в 61 живий організм, в результаті якого досягається їх включення і актив- ність в цьому організмі і у його потомства. Мета прикладної генетичної інженерії полягає в конструюванні та- ких рекомбінантних молекул ДНК, які при впровадженні в генетичний апарат додавали б організму властивості, корисні для людини. Наприклад, отримання «біологічних реакторів» – мікроорганізмів, рослин і тварин, що продукують фармакологічно значущі для людини речовини, створення сортів рослин і порід тварин з певними цінними для людини ознаками. Методи генної інженерії дозволяють провести ге- нетичну паспортизацію, діагностувати генетичні захворювання, створю- вати ДНК-вакцину, проводити генотерапію різних захворювань. Формально датою народження генетичної інженерії слід вважати 1972 рік, коли в Стенфордському університеті П. Берг, С. Коен, Х. Бойер із співробітниками створили першу рекомбінантну ДНК, що міс- тила фрагменти ДНК вірусу SV40 (поліомавірус – викликає розвиток пу- хлин, ним була заражена вакцина від поліомієліту у 1960 р.), бактеріофа- га і E. coli. Основні етапи вирішення завдань генної інженерії наступні: 1. Отримання ізольованого гена. 2. Введення гена у вектор для перенесення в організм. 3. Перенесення вектора з геном в організм, що модифікується. 4. Перетворення клітин організму. 5. Відбір генетично модифікованих організмів (ГМО) і усунення тих, які не були успішно модифіковані. Процес синтезу генів в даний час розроблений дуже добре і навіть в значній мірі автоматизований. Існують спеціальні апарати, забезпечені ЕОМ, в пам’яті яких закладають програми синтезу різних нуклеотидних послідовностей. Такий апарат синтезує відрізки ДНК завдовжки до 100— 120 азотистих основ (олігонуклеотиди). 62 2. МЕТОДИ ТЕХНОЛОГІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК Технологія рекомбінантних ДНК використовує наступні методи:  специфічне розщеплювання ДНК рестрикційними нуклеазами;  виділення і маніпуляції з окремими генами;  швидке секвенування (визначення нуклеотидної послідовності) всіх нуклеотидів в очищеному фрагменті ДНК, що дозволяє визначити межі гена і амінокислотну послідовність, що кодується ним;  конструювання рекомбінантної ДНК;  гібридизація нуклеїнових кислот, що дозволяє виявляти специфічні послідовності РНК або ДНК з більшою точністю і чутливістю, засно- вану на їх здатності зв’язувати комплементарні послідовності нуклеї- нових кислот;  клонування ДНК: ампліфікація in vitro за допомогою ланцюгової по- лімеразної реакції або введення фрагмента ДНК в бактеріальну клі- тину, яка після такої трансформації відтворює цей фрагмент в міль- йонах копій;  введення рекомбінантної ДНК в клітини або організми. 2.1. Ферменти, що використовуються в генній інженерії При роботі з макромолекулами ДНК і РНК ферменти виступають в ролі «скальпеля», «ножиць» і «ниток для зшивання». Крім того, ферменти виконують функції реплікації ДНК (подвоєння), репарації пошкоджень (відновлення цілісності молекули), беруть участь в процесах прочитування і перенесення генетичної інформації з клітини в клітину або в її межах. Завдання генного інженера – підібрати фермент, який виконав би поставлені завдання, тобто зміг би працювати з певною ділянкою нукле- їнової кислоти. Слід зазначити, що ферменти, що використовуються в генній інже- нерії, позбавлені видової специфічності. 63 Їх розділяють на декілька груп:  ферменти, за допомогою яких отримують фрагменти ДНК (рестрик- тази);  ферменти, що синтезують ДНК на матриці ДНК (полімерази) або РНК (зворотні транскриптази);  ферменти, що сполучають фрагменти ДНК (лігази);  ферменти, що дозволяють здійснити зміну структури кінців фрагме- нтів ДНК. 2.2. Визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК Секвенування ДНК (від англ. «sequence» – послідовність) – визначен- ня послідовності нуклеотидів у ланцюгу ДНК. Використовується для ро- зшифровки генів і занесення цієї інформації до банку даних та її подаль- шої інтерпретації методами біоінформатики. Секвенування дозволяє до- сить швидко визначити повну нуклеотидну послідовність сегменту дов- жиною 100-500 нуклеотидних пар, що утворюється при розщеплюванні ДНК-рестрикційними ендонуклеазами. Історія секвенування ДНК. Уперше геном був розшифрований у найпримітивніших живих істот – вірусів. Першими розшифровані ДНК вірусу натуральної віспи (1993), геном цитомегаловірусу, геном вірусу осповакцини, а також геноми органоїдів клітин еукаріотів – мітохондріа- льний геном і хлоропластний моху, хлоропластний геном евглени Euglena polymorpha. Перший геном самостійного живого організму, який вдалося секве- нувати, належить бактерії Haemophilus influenzae (1995). У виконанні проекту взяло участь 40 науковців з 4 дослідницьких центрів США. Далі пішла серія аналогічних робіт, наприклад, над геномами Mycoplasma genitalum (1995), архебактерії Methanococcus jannaschii (1996), бактерії Methanobacterium thermoautotrophicum, кишкової палички Escherichia coli (1997) та багато інших. У 1996 році завершено роботу над розшифровкою генома першого еукаріотичного організму – дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Над цим 64 проектом працювала ціла мережа дослідних центрів і лабораторій у США, Західній Європі та Японії. Для секвенування ДНК застосовуються методи Едмана, Сенгера та інші; у даний час для секвенування нуклеїнових кислот найбільш попу- лярним є метод Сенгера з дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Згідно методикам до початку секвенування з використанням полі- меразної ланцюгової реакції (ПЛР) виконують ампліфікацію (збільшення числа копій) досліджуваної ділянки ДНК, послідовність якої потрібно ви- значити (див. нижче). Метод Сенгера (ферментативний). Метод, розроблений Сенгером і заснований не на хімічному, а на фе- рментативному підході. Cенгер використовував ДНК-полімеразу I. У клі- тині цей фермент бере участь в процесі реплікації, заповнюючи пропуски між знову синтезованими фрагментами ДНК (фрагментами Оказакі). Для роботи ферменту в пробірці потрібні попередники ДНК – дезоксирибо- нуклеотидтрифосфати (dNTP), а також одноланцюгова матриця, на якій повинна бути невелика дволанцюгова ділянка, – приманка, з якої почи- нається синтез. Також для кожної з чотирьох основ ДНК були синтезова- ні модифіковані дидезоксирибонуклеотиди (ddNTP), в яких дезоксири- боза 3’-ОН відсутня. ДНК-полімераза включає ці попередники в ДНК. Проте, включившись в ДНК, модифікована основа не може утворити фо- сфодиефірний зв’язок з наступним дезоксирибонуклеотидом. В резуль- таті ріст (елонгація) даного ланцюга зупиняється (термінує) в тому місці, де в ДНК включився дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Тому їх назива- ють термінаторами елонгації. Реакційна суміш по Сенгеру складається з ланцюга ДНК, нуклеотид- ну послідовність якої треба визначити, короткого фрагмента «міченої» ДНК, комплементарної кінцевому відрізку цього ланцюга (приманка), одного з чотирьох ddNTP і відповідного dNTP в строго певному співвід- ношенні (щоб вони конкурували), а також останніх три dNTP. Готують чотири суміші, кожна з яких містить один з чотирьох ddNTP. У кожній з пробірок утворюється набір мічених фрагментів різної довжини. Довжи- на їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють в поліакриламі- 65 дному гелі (з точністю до одного нуклеотида), проводять радіоавтогра- фію і по картині розподілу фрагментів в чотирьох пробах встановлюють нуклеотидну послідовність ДНК. Довжина цих фрагментів у нуклеотидах визначить порядковий номер нуклеотиду в складі ланцюга. З метою ви- значення довжини фрагментів проводять гель-електрофорез. (Принцип електрофорезу дуже простий. Суміш фрагментів ДНК (або РНК) нано- сять у лунку пластинки гелю – середовища, сформованого полімерною сі- ткою. Зазвичай гель виготовляють на основі агарози або поліакриламіду. Через нього пропускають електричний струм, завдяки чому негативно заряджені молекули нуклеїнової кислоти рухаються в електричному полі. Полімерна сітка гелю створює для цього руху суттєвий опір, якій дола- ється тим легше, чим меншим є розмір фрагмента. Через певний час фра- гменти розділяються на окремі зони – смуги гелю, які містять гомоген- ний набір фрагментів одного розміру. Для візуалізації смуг гель забарв- люють флуоресцентним барвником (найчастіше використовують бро- мистий етидій), який зв’язується з ДНК. Після цього смугу можна виріза- ти з гелю, та екстрагувати ДНК.). Після електрофорезу та візуалізації смуг із такого гелю можна про- читати нуклеотидну послідовність. В іншому методі секвенування – методі Максама-Гілберта (Allan M. Maxam, Walter Gilbert) замість ферментативного синтезу застосовують хі- мічне розрізання ланцюга на нуклеотиди певного типу. Отримані фрагме- нти різної довжини так само розділяють за допомогою електрофорезу. Метод Сенгера використовується сьогодні автоматичними секвена- торами, в яких замість радіоактивно-мічених застосовуються флуорес- центно-мічені праймери. Для кожної з чотирьох реакцій беруть чотири різні флуоресцентні мітки, котрі випромінюють світло в різних спектра- льних діапазонах. Продукти всіх чотирьох реакцій наносять на гель для електрофорезу разом. Сканування гелю після електрофорезу лазерним променем, що збуджує флуоресценцію, дозволяє дискримінувати проду- кти різних реакцій, тобто різні кінцеві нуклеотиди, і, таким чином, не- гайно прочитати послідовність. Здійснення секвенування кожного із фрагментів, які містяться в ге- номній бібліотеці клонів, і порівняння послідовностей фрагментів, що 66 перекриваються, дозволяє розмістити клоновані фрагменти в порядку їхньої локалізації в геномі, тобто встановити повну послідовність геному. Інший сучасний підхід у секвенуванні геномів (так зване піросекве- нування), який реалізується на автоматизованих секвенаторах, дозволяє визначити послідовність значно швидше, дешевше і при цьому не потре- бує ані клонування ДНК, ані електрофорезу. Одноланцюгові фрагменти, отримані з невеликої кількості геномної ДНК, пришивають 5’-кінцями до мікрокульок (один фрагмент на кульку) та ампліфікують за допомогою ПЛР. Кожну кульку із пришитими до неї ампліфікованими ідентичними фрагментами розміщують у мікрореакторі, де здійснюється ДНК- полімеразна реакція. Нуклеозидтрифосфати подаються в реакційну су- міш імпульсно один за одним. Якщо нуклеотид певного типу виявляєть- ся комплементарним матриці та включається у зростаючий ланцюг, пі- рофосфат, що при цьому звільняється, залучається до низки хімічних ре- акцій, де остання реакція супроводжується випромінюванням світла (хе- мілюмінесценція). Світловий сигнал фіксується оптичною системою, і послідовність таких сигналів читається як нуклеотидна послідовність. Реакція здійснюється паралельно у 200 тис. Мікрореакторів (для 200 тис. фрагментів, які перекриваються), що дозволяє встановити послідовність приблизно 200 млн пар основ за 4,5 години. Останнім часом з’явилася нова перспектива секвенування ДНК у процесі протягування молекули через нанопору. Пóра діаметром ~1 нм утворюється у кремнієвій мембрані, і одноланцюгова ДНК досить пові- льно проходить крізь цю пору під дією електричного поля. Виявилося, що характеристики електричного струму через мембрану залежать від того, який нуклеотид знаходиться в порі в даний момент. Є сподівання, що з розвитком цього методу з’явиться можливість швидкого та дешево- го секвенування геному однієї конкретної людини. В даний час визначення точної нуклеотидної послідовності будь- якого сегменту ДНК помірної довжини – цілком вирішуване завдання. Вже визначена послідовність декількох сотень генів про- і еукаріот. Зна- ючи послідовність гена і генетичний код, легко визначити амінокислот- ну послідовність кодованого ним білка. Раніше для визначення структу- ри білка доводилося робити ретельний і вельми трудомісткий аналіз ви- 67 діленого і очищеного білка. Зараз часто буває простіше визначити струк- туру білка через нуклеотидну послідовність, ніж за допомогою прямого секвенування. Якщо секвенування білка займає місяці і навіть роки, то ДНК вдається секвенувати за декілька тижнів. Визначення послідовності ДНК призвело також до того, що були ви- явлені області, які не кодують білки, але беруть участь в регуляції екс- пресії генів і реплікації ДНК. У 1996 році був секвенований геном дріж- джів, в 1998 р. – геном арабідопсісу, в 2000 році – геном людини, проте в даному випадку мова йде тільки про встановлення послідовності нукле- отидів, оскільки генетична структура і функції окремих ділянок генома ще не ідентифіковані, це складніше завдання. Метод Едмана (англ. Edman degradation) – один з ранніх методів ви- значення первинної послідовності (секвенування) пептидів. Розробле- ний в 1950-1956 роках шведським біохіміком Пером Віктором Едманом. Суть методу полягає в обробці досліджуваного пептиду певним набором реагентів, що приводить до відщеплення однієї амінокислоти з N-кінця послідовності. Циклічне повторення реакції і аналіз продуктів реакцій дають інформацію про послідовність амінокислот в пептиді. Метод Ед- мана був широко поширений в другій половині ХХ століття. В даний час практично не застосовується із-за багатьох властивих йому недоліків (некількісне протікання реакції, множинні побічні процеси). 2.3. Гібридизація як високочутливий метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів При нагріванні водного розчину ДНК до 100оС і підвищенні рН до 13, ДНК дисоціює на 2 ланцюги (денатурує), оскільки комплементарні зв’язки між основами руйнуються. Цей процес обернений. Так, витримка ДНК при температурі 65оС вела до відновлення структури подвійної спі- ралі. Це процес ренатурації або гібридизації. Процеси гібридизації відбу- ваються між будь-якими одинарними ланцюгами, якщо вони комплеме- нтарні: ДНК – ДНК, РНК – РНК, ДНК – РНК. Процес гібридизації використовують для виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів. Для цього необхідно мати чистий однолан- 68 цюговий фрагмент ДНК, комплементарний тій послідовності, яку хочуть виявити. Цей фрагмент отримують або клонуванням, або шляхом хіміч- ного синтезу. Одноланцюгова ДНК, яка використовується як індикатор, називається ДНК-зонд. Вона може містити від 15 до 1000 нуклеотидів. ДНК-зонд застосовується в різних цілях. Гібридизація ДНК-зонда з РНК, виділеної з аналізованої клітини, може виявити наявність або від- сутність експресії гена. Якщо гібридизації не відбувається, це означає, що ген не працює. ДНК-зонд також дозволяє проводити діагностику спадко- вих хвороб. Одним з найбільш точних і сучасних методів аналізу є використання чіпів. Вони є пластинками з імобілізованими міченими ДНК-зондами. Кожна така пластинка може містити декілька десятків тисяч зондів, роз- ташованих в певній послідовності. Мітка виявляється тільки в спарених дволанцюжкових фрагментах. Якщо в досліджуваному зразку є послідо- вності, комплементарні послідовностям зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Як прави- ло, детектори сполучені з комп’ютером, тобто процедура прочитування і обробки інформації автоматизована. Таку ДНК-чіп можна застосовувати для комплексної діагностики ін- фекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих або інших генів (в цьому випадку йде гібридизація з мРНК), тобто відс- тежування порушень обміну речовин. Вони дешеві, дуже надійні, прості в обігу і можуть багато разів використовуватися. Недолік – дорога апара- тура для детекції. 2.4. Методи клонування ДНК Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід припускає ви- користання бактерійних або дріжджових клітин для розмноження вве- деної в них чужорідної ДНК. Другий спосіб є ампліфікація ДНК in vitro. Ампліфікація (лат. amplificatio – посилення, збільшення) – збільшення числа копій ДНК. У клітині ампліфікація відбувається в результаті реплі- кації ДНК, в штучних умовах збільшення числа копій ДНК досягають за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. 69 ПЛР – експериментальний метод, що дозволяє досягнути значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі). Метод заснований на багатократному вибірковому копіюванні пев- ної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо вона присутня в досліджу- ваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах (реп- лікації), за допомогою ПЛР ампліфікуються відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованої ДНК-ділянки скла- дає не більше 3000 пар основ. За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умов довжина ПЛР-фрагмента може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Практично ПЛР – це реакція синтезу ДНК in vitro, яка повторюється ба- гато разів: синтезовані ланцюги стають матрицями для синтезу в наступно- му циклі реакції. Для здійснення ПЛР треба знати принаймні короткі послі- довновсті ДНК на кінцях того фрагмента, котрий має бути ампліфікований. ПЛР проводять в ампліфікаторі – приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 °C. Сучасні ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, зо- крема з можливістю «гарячого старту» і подальшого зберігання ампліфі- кованих молекул при 4 °C. Для проведення найпростішої ПЛР потрібні такі компоненти:  ДНК-матриця, тобто фрагмент ДНК, що містить ту ділянку, яку потрі- бно ампліфікувати.  Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагменту.  Термостабільна ДНК-полімераза.  Дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T).  Буферний розчин. Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій: 1. Денатурація. Дволанцюжкову ДНК-матрицю нагрівають до 94- 96 °C на 0,5-2 хв., щоб ланцюги ДНК розійшлися – це процес денатурації. 70 2. Відпал. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують до 60 °С, щоб праймери могли зв’язатися з одноланцюговою матрицею. При температурі 60 °С ланцюги ДНК не ренатурують, але праймери (оскільки вони присутні в досить високих концентраціях) знаходять свої компле- ментарні ділянки й зв’язуються з ними. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибира- ється на 4-5°С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії – 0,5-2 хв. 3. Елонгація. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, викори- стовуючи праймер як приманку. Це – стадія елонгації. Час елонгації за- лежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфікуючого фрагмента. Середня швидкість елонгації – 1000 пар основ за 1 хв. Ця ста- дія триває 7-10 хв. Після 30-го циклу кількість таких коротких матриць буде в мільйон разів більша, ніж вихідних довгих матриць. Застосування полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР): 1. Ізоляція генетичного матеріалу. За допомогою ПЛР можна ізолювати специфічні послідовності ДНК з цілого генома. 2. Секвенування ДНК і виявлення генетичних хвороб. ПЛР дозволяє ви- значити послідовність нуклеотидів в ДНК, в тому числі і змінених при генетичних захворюваннях. 3. Методи рекомбінації ДНК. ПЛР часто використовується для ампліфі- кації гена, який потім може бути вставлений в інший геном через від- повідний процес рекомбінації. 4. Використання в криміналістиці та встановлення батьківства. ПЛР ви- користовується у методі генетичних відбитків пальців, за допомогою якого ідентифікують людину, порівнюючи її ДНК з ДНК в наданому зразку. 5. Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК. Оскільки ПЛР ампліфі- кує частини ДНК, він може використовуватися для аналізу надзви- чайно невеликих кількостей зразку. Крім того, кількість часу, потріб- на для ампліфікації ДНК до наданого рівня, залежить від її кількості в початковому зразку, завдяки чому ПЛР може також використовува- тися для визначення кількості ДНК. 71 6. Аналіз ДНК у зразках, що довго зберігалися. Використовуючи ПЛР, стає можливим проаналізувати ДНК, якій кілька тисяч років. Методи ПЛР були успішно використані на деяких стародавніх тваринах, на- приклад мамонті віком у 40 тис. років та на людській ДНК з стародав- ніх гробниць, наприклад, єгипетських мумій. 7. Ідентифікація вірусної ДНК. Вірусні захворювання також можуть бути ідентифіковані за допомогою ПЛР. Використовуючи праймери, спе- цифічні для даного віруса, ПЛР може успішно ампліфікувати ДНК та виявити, чи присутній в ньому вірус. Оскільки ПЛР дуже чутливий, такий аналіз дозволяє виявити вірус до появи фактичних симптомів захворювання. 2.5. Введення гена в клітину Ввести рекомбінантний ген в клітину можна 2 способами: викорис- товуючи вектори або шляхом прямого введення. 1 спосіб – за допомогою векторів. Вектор – молекула нуклеїнової кислоти, частіше за все ДНК, що використовується в генетичній інженерії для передачі генетичного матеріалу іншій клітині. Відповідно вектор складається з двох компонентів: векторної частини (носія) і клонованого чужорідного гена. Завдання вектора – донести вибрану ДНК в клітину- рецепієнт, вбудувати її в геном, дозволити ідентифікацію трансформо- ваних клітин, забезпечити стабільну експресію введеного гена. Таким чином, вектор повинен бути невеликим, здатним підтримува- тися в клітині-господарі (реплікуватись), багато разів копіюватися (амп- ліфікувати), експресувати відповідний ген (містити відповідні регулято- рні послідовності), мати маркерний ген, що дозволяє розрізняти гібридні клітини для ефективної їх селекції, здатним передаватися в клітину від- повідного організму. Типи векторів для введення гена в клітину. Існує декілька типів векторів:  Бактерійні плазміди Основна маса клітинної ДНК бактерій міститься в хромосомі. Проте окрім хромосом бактерії містять велику кількість дуже маленьких кіль- 72 цевих молекул ДНК плазмід завдовжки декілька тисяч пар основ. Такі міні-хромосоми називають плазмідами. Як правило, плазміди мають в своєму складі гени стійкості до анти- біотиків, іонів важких металів (R-плазміди), а також гени, що контролю- ють катаболізм деяких органічних сполук (плазміди біодеградації, або D- плазміди). Оскільки ці гени знаходяться в плазмідах, вони представлені набагато більшим числом копій. Плазміди виділяють з різних штамів і видів бактерій. Оскільки плазмідна ДНК значно менша хромосомної, її досить легко виділити в чистому вигляді. У присутності іонів кальцію плазміди легко поглинаються бактеріями-рецепієнтами, навіть якщо ті їх ніколи не міс- тили, і в клітинах бактерійного потомства можна виявити багато копій поглиненої плазміди.  Віруси Є віруси, які не ведуть до загибелі клітини, але вбудовуються в ге- ном клітини-господаря і розмножуються разом з нею, або викликають її неконтрольований ріст, тобто перетворюють на ракову. До таких відно- сяться ДНК-віруси SV-40 (поліомавірус). Для бактерійних клітин як век- тор часто використовують бактеріофаги. Віруси є одними з головних кандидатів на роль векторів для вве- дення чужорідної ДНК. При вірусній інфекції кожна клітина може отри- мати велике число копій чужорідного гена. ДНК можна вбудовувати так, щоб вона знаходилася під контролем сильних вірусних промоторів, що забезпечить високий рівень експресії гена, і його продукти будуть дос- тупніші для дослідження. Вірус повинен бути життєздатним після рекомбінування його ДНК. Найлегше віруси вводяться в бактерії. Недоліком вірусів як векторів є їх невелика ємкість. Крім того, віруси інфікують невелике коло господарів. Існують гібридні вектори, такі, що містять ДНК фага і плазміди. До них відносяться, наприклад, косміди і фазміди.  Косміди – плазмідні вектори, в яких вбудована ділянка генома фага, що забезпечує можливість упаковки цієї молекули ДНК у фагову час- тинку. Фагові частинки забезпечують хороше проникнення гібридної 73 ДНК в клітину (шляхом ін’єкції), після чого відбувається замикання ДНК в кільце по липких кінцях і реплікація її за плазмідним типом.  Фазміди також є гібридами між фагом і плазмідою. Після вбудову- вання чужорідної ДНК можуть в одних умовах розвиватися як фаги, в інших – як плазміди.  Плазміди агробактерій Як вектори можуть використовуватися пухлиноподібні плазміди ба- ктерій. Види Agrobacterium еволюційно споріднені бульбочковим бакте- ріям, що відносяться до роду Rhizobium, і мають багато загальних з ними рис. Проте характер взаємодії агробактерій з рослиною має своєрідні особливості. Взаємодія видів Agrobacterium з рослинами представляє особливий інтерес, оскільки при цьому виді паразитизму один з партнерів специфі- чно видозмінює властивості господаря, вбудовувавши свої гени в його геном. Крім того, це служить унікальним прикладом міграції ДНК прока- ріот в еукаріотичну клітину. Завдяки здатності Agrobacterium tumefaciens трансформувати клі- тини рослин, ця бактерія зараз активно використовується для перене- сення генетичного матеріалу з метою генетичної модифікації рослин.  ДНК мітохондрій і хлоропластів Хлоропласти і мітохондрії містять повноцінну генетичну систему, тобто всі компоненти, необхідні для експресії генетичної інформації: ДНК, ДНК-полімерази, РНК-полімерази і білоксинтезуючий апарат (рибо- соми, т-РНК, аміноацил-тРНК-синтетази). Хлоропластна і мітохондріаль- на ДНК також привертають увагу учених як можливі вектори для пере- несення генів в клітину. 2 спосіб – пряме введення генів в клітину. Пряме введення гена в клітину здійснюють декількома способами:  Трансфекція.  Мікроін’єкція.  Електропорація.  Метод «міні-клітин». 74  Упаковка в ліпосоми.  Електронна гармата. При трансфекції ДНК адсорбується на кристалах фосфату кальцію (Грехем Ван дер Еб, 1973). Утворюються частинки кальцієвого преципі- тату (осаду). Вони поглинаються клітиною шляхом фагоцитозу. Мікроін’єкція ДНК в клітини ссавців стала можливою з появою приладу для виготовлення мікропіпеток діаметром 0,1-0,5 мікрона і мік- романіпулятора (рис. 7). Метод введення ДНК за допомогою мікро- ін’єкцій був розроблений на початку 70-х років Андерсоном і Діакумако- сом. За 1 годину можна ін’єктувати 500-1000 клітин. Перевага описува- ного методу полягає також в тому, що він дозволяє вводити будь-яку ДНК в будь-які клітини, і для збереження в клітинах введеного гена не потрібний ніякий селективний тиск. Мікропіпетка з ДНК Рис. 7. Введення ДНК шляхом мікроін’єкції Електропорація заснована на тому, що імпульси високої напруги зворотно збільшують проникність біомембран. В середовище для елект- ропорації додають клітини і фрагменти ДНК, яку необхідно ввести в клі- тини. Через середовище пропускають високовольтні імпульси, що приз- водять до утворення пор в мембрані цитоплазми, час існування і розмір яких достатні, щоб такі макромолекули, як ДНК, могли із зовнішнього середовища увійти до клітини в результаті дії осмотичних сил. При цьо- му об’єм клітини збільшується. 75 Розчин ДНК Електрод Електрод Рис. 8. Метод електропорації «Міні-клітини» отримують шляхом блокування донорних клітин мі- тозу колцемідом. При тривалій обробці клітин колцемідом в них навколо кожної хромосоми формується нова ядерна мембрана. Обробка цитохала- зином В і центрифугування призводить до утворення міні-клітин, що пред- ставляють мікроядра, інкапсульовані в мембрану цитоплазми. Отримані міні-клітини дуже чутливі до різного роду дій, тому для злиття підбирають спеціальні умови. Метод важкий і ефективність його низька. Упаковка в ліпосоми використовується для захисту екзогенного генетичного матеріалу від руйнуючої дії рестриктаз. Ліпосоми – сферичні оболонки, що складаються з фосфоліпідів. Отримують їх шляхом різкого струшування суміші водного розчину і лі- підів, або обробляючи ультразвуком водні емульсії фосфоліпідів. Систе- ми перенесення за допомогою ліпосом низькотоксичні по відношенню до клітин. Метод електронної гармати є одним з найефективніших на сього- днішній день методів трансформації рослин, особливо однодольних. Суть методу полягає в тому, що на найдрібніші частинки вольфраму, золота, силікону, напилюється ДНК вектор, що містить необхідну для трансформації генну конструкцію. Мікрочастинки, що несуть ДНК, нано- сяться на целофанову підкладку і поміщаються всередину біолістичної гармати. Калус або суспензія клітин наноситься в чашку Петрі з агаризо- ваним середовищем і поміщається під біолістичну гармату на відстані 76 10-15 см. У гарматі вакуумним насосом зменшується тиск до 0,1 атм. У момент скидання тиску мікрочастинки з величезною швидкістю вики- даються з біолістичної гармати і, розриваючи клітинні стінки, входять в цитоплазму і ядро клітин. Зазвичай клітини, розташовані безпосередньо по центру, гинуть че- рез величезну кількість і тиск мікрочастинок, тоді як в зоні 0,6-1 см від центру знаходяться найбільш вдало протрансформовані клітини. Далі клітини обережно переносять на середовище для подальшого культиву- вання і регенерації. 3. ТРАНСГЕННІ РОСЛИНИ І ТВАРИНИ. ПЕРСПЕКТИВИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ 3.1. Області застосування генної інженерії рослин 1. Метаболічна інженерія. У рослин вона спрямована на проведення трансгенною клітиною нових біохімічних реакцій шляхом введення чужорідних генів або модифікацією генів клітини-господаря. Рослини – один з найбільш привабливих об’єктів для метаболічної інженерії. Маючи однакові шляхи синтезу основних біоло- гічних сполук, рослини відрізняються вражаючою різноманітністю своїх кі- нцевих продуктів: цукрами, ароматичними сполуками, жирними кислотами, стероїдними сполуками та іншими біологічно активними речовинами. Багато з цих сполук представляють велику цінність для фармакології. Іноді такими продуцентами важливих лікарських речовин є уніка- льні тропічні та ендемічні рослини, недоступні для їх вирощування в по- мірних кліматичних зонах більшості розвинених країн світу. Виділення з таких рослин генів, що визначають спрямований синтез специфічних ор- ганічних сполук, і їх перенесення в підібрані відповідні рослини перетво- рюють їх на нові продуценти важливих біологічно активних речовин. Прикладом метаболічної інженерії є одержання нових рослин- продуцентів резвератролу, цінного лікарського препарату широкого 77 спектру дії, що уповільнює старіння. Резвератрол – фітоалексин – анти- бактеріальна та протигрибкова речовина, що виробляється рослинами у відповідь на інфекцію патогенів. Був виявлений у винограді. 2. Створення рослин з поліпшеними лікувально-дієтичними властивостями. Це допоможе поліпшити харчову цінність рослин. Наприклад, нещодавно отримані трансгенні рослини суниці з під- вищеним синтезом аскорбінової кислоти. Створені рослини сої з під- вищеним в п’ять разів вмістом вітаміну Е в насінні. Вже існує салат зі збільшеним вмістом заліза, збагачена лізином кукурудза. 3. Створення рослин, стійких до гербіцидів. Найпоширенішими є трансгенні рослини, стійкі до гліфосату (Рау- ндап) – найпопулярнішого гербіциду, що розкладається в грунті на не- токсичні складові і тому безпечного для навколишнього середовища. Ген був виділений з гліфосат-стійкого штаму E. coli. 4. Виведення рослин, стійких до шкідників і хвороб. Перші стійкі до шкідників рослини, створені за допомогою методів генної інженерії, були введені в культуру в 90-х роках минуло сторіччя. Ці генетично модіфіковані рослини (Bt-культури) несуть гени грампози- тивної аеробної спороутворюючої бактерії Bacillus thuringiensis, яка син- тезує параспоральні (локалізовані поруч зі спорою) кристалічні утво- рення, що містять d-ендотоксин – Cry-білки, що вбивають личинок комах різних порядків. Одними з перших в широку практику увійшли інсектицидні бавовна і кукурудза. Cry-білок є протоксином, який розщеплюється в кишечнику личинок комах, утворюючи активований токсин. Активований токсин, в свою чергу, специфічно зв’язується з рецепторами в середній кишці ко- мах, що призводить до лізису клітин кишкового епітелію. Даний ентомо- токсин – смертельна отрута для ряду комах (в тому числі і колорадського жука), але в той же час цілком безпечний для людини і тварин, оскільки в організмі ссавців немає ферментів для його розщеплення і засвоєння. Введення гена протоксину в рослини призвело до того, що Bt-рослини 78 перестали поїдатися комахами. Цим шляхом було отримано трансгенну картоплю, стійку до колорадського жука. 5. Виведення стійких до вірусів рослин. Стійкість до вірусів є важливим для підвищення сільськогосподар- ської продуктивності. В даний час в різних країнах світу проводять польові випробування стійких до вірусів сортів батату, кукурудзи та аф- риканської маніоки. Можливо, ці культури будуть комерціалізовані про- тягом найближчих 3-5 років. Розроблено стійкий до нематод (круглі чер- ви) сорт ГМ-картоплі. 6. Фармакологія. Рослини є зручною, безпечною та економічно вигідною альтернати- вою для отримання різних білків, вакцин і антитіл у порівнянні з систе- мами експресії на основі мікроорганізмів, культур клітин тварин або трансгенних тварин. За останні 20 років безліч цінних білків ефективно екпресовано в рослинах. Це білки людської сироватки, регулятори росту, антитіла, вак- цини, промислові ферменти, біополімери тощо. Перспективне отримання ГМ-рослин, що синтезують нові форми антимікробних пептидів. Деякі білки, що синтезуються трансгенними рослинами, вже виробля- ються західними компаніями або будуть випущені на ринок у найближчі роки. Наприклад, трипсин (травний фермент, що розщеплює білки) та β- глюкуронідаза (фермент, що розщеплює глюкуронід з утвоернням глюку- ронової кислоти і спирту), що виділяються з трансгенної кукурудзи, виро- бляються фірмою Sigma-Aldrich (США). Незабаром повинні будуть підгото- влені до промислового виробництва коллаген (білок сполучної тканини), ліпаза (фермент, що розщеплює жири), лактоферин (білок, що міститься в грудному молоці та інших рідинах організму і є одним з компонентів імун- ної системи), лізоцим (фермент, що руйнує клітинну оболонку бактерій, міститься в слині, сльозах), синтезовані трансгенними рослинами. 7. Синтез вакцин в трансгенних рослинах. В даний час більше 50 різних антигенів були експресовані в ГМ- рослинах. Для деяких з них показана імуногенність при оральному введен- 79 ні. Інтенсивно розробляється концепція «їстівних вакцин» на основі транс- генних рослин, чиї плоди, листя і насіння годяться в їжу, з вбудованим від- повідним фрагментом геному патогенного мікроорганізму, який викликає в організмі людини чи тварини утворення антитіл, що формують імунітет. З урахуванням необхідності використання цих вакцинних продуктів у си- рому вигляді, досліджується вирощування вакцин на рослинах, які не пот- ребують кулінарної обробки перед вживанням: бананах, томатах, салаті. У разі успіху зникне потреба у вартісному очищенні антигенів, яка необхідна при створенні вакцин для парентерального введення (спосіб введення в організм лікарських та інших речовин, минаючи шлунково- кишковий тракт, наприклад, підшкірне упорскування, внутрішньовенне вливання та ін.). Антигени, які експресуються в рослинах, захищені рос- линними клітинними стінками від протеолізу при проходженні травним трактом і можуть бути легко доставлені до клітин слизової оболонки кишечника, що відповідають за імунні відповіді організму. Перша така вакцина була одержана у 1992 році: трансгенна рослина табаку стала продукувати «австралійський» антиген. Одержаний з рос- лин та частково очищений антиген, введений мишам, викликав імунну відповідь подібно до вакцини проти гепатиту В. У 1998 році за допомо- гою картоплі, що продукує В-субодиницю холерного анатоксину, було одержано виражений захист у мишей, до раціону яких входила трансген- на картопля, при зараженні їх холерою. Аналогічна вакцина проти кору була одержана на табаку. Перший клінічний досвід з випробування хар- чових вакцин на людині відбувся в 1997 році, коли добровольці їли гене- тично змінену сиру картоплю з протидіарейними генами. Десять з оди- надцяти добровольців, які отримали по 100 грамів сирої картоплі, що продукує антигени ентеропатогенної кишечної палички, мали вчетверо підвищений рівень антитіл до цього збудника, які почали вироблятися у слизовій оболонці кишечника. Випробовуються «картопляні» вакцини до вірусу Ньюарк (збудника діареї) та гепатиту В. На тваринах досліджу- ються вакцини проти сказу, вирощені на томатах. 80 3.2. Комерціалізація трансгенних рослин і біобезпека З моменту публікації в 1983 р. перших робіт з отримання трансгенних рослин тютюну кількість існуючих зараз трансгенних рослин уже не підда- ється обліку. В даний час в сільськогосподарському виробництві загальні площі біотехнологічних культур досягли вже 114 300 000 га. Крім того, сот- ні сортів десятків видів харчових і технічних рослин з найрізноманітнішими новими властивостями чекають дозволу на комерційне використання. Найпоширенішими з трансгенних сільськогосподарських рослин є соя (51%), далі кукурудза (31%), бавовна (13%) і ріпак (5%). Необхідно відзначити, що деякі генно-модифіковані культури (на- приклад, ГМ-соя) вже обігнали по захопленій площі свої «традиційні» аналоги. Починає збільшуватися частка культивованих трансгенних рослин, стійких до вірусів, грибків, нематод та інших шкідників, холоду, спеки, засухи або тих, що довго не псуються при зберіганні. Нові сорти здатні рости там, де старі просто не могли вижити. На- приклад, Північна Дакота, що раніше вважалася не придатною для виро- щування соєвих бобів, в даний час вже стала одним з головних постача- льників цієї культури в США. Широке поширення сільськогосподарських трансгенних рослин по- яснюється тим, що їх культивування дозволило фермерам різко підви- щити врожаї, при цьому знизити закупівлі гербіцидів та закупівлі інсек- тицидів. Наприклад, проведені в Індії і Китаї в 2007 р. дослідження пока- зали, що використання Bt-бавовни дало можливість збільшити врожай- ність до 50 і 10% відповідно і скоротити використання інсектицидів в обох країнах до 50% і більше. Трансгенні посадки продовжують розростатися по всьому світу. У середньому за рік вони збільшуються на 10-15%. Безсумнівним лідером в культивуванні трансгенних рослин, як і раніше залишаються США. Генно-інженерні сільськогосподарські культури дозволять виріши- ти продовольчу проблему. Так, чисельність населення планети станом на 2011 рік становить 7 млрд, в рік збільшуючись приблизно на 80 млн. За прогнозами ООН, до 2020 р. населення Землі зросте з нинішніх до 7,5 млрд чол., а до 2050 року перевищить 9,5 млрд чол. Вже сьогодні бли- 81 зько 800 млн чол. у світі голодують. В подальшому ця проблема лише за- гостриться, оскільки збільшення виробництва продуктів харчування стало відставати від приросту населення. Зростання споживання ГМ- продуктів вважається одним із способів боротьби з голодом. Сьогодні в багатьох країнах світу практично неможливо уникнути вживання генетично модифікованих рослин. Так, з великою часткою ймовірності можна сказати, що практично всі продукти, вироблені з ви- користанням кукурудзяного, соєвого або бавовняного масла, містять ге- нетично змінений матеріал. Біобезпека трансгенних рослин залишається предметом гострих дискусій у суспільстві. Існує думка, що трансгенні рослини здатні негативно впливати на навколишнє середовище. По-перше, існує побоювання, що стійкі до гербіцидів культурні рос- лини можуть при міжвидовому запиленні передавати ці гени близькос- порідненим бур’янам, які можуть перетворитися на незламні супер- бур’яни (superweeds). Хоча вірогідність такого небажаного розвитку по- дій для більшості сільськогосподарських культур дуже мала, генні інже- нери активно розробляють підходи для виключення подібної небезпеки. Наприклад, пробують вводити в рослини не один, а відразу декілька ге- нів стійкості до різних гербіцидів. Передача декількох генів бур’янам на- багато менш вірогідна, ніж одного гена. Пропонується також вводити ге- ни стійкості не в ядерний, а в хлоропластний геном. Це може запобігти небажаному дрейфу генів за допомогою пилку, оскільки ДНК хлороплас- тів успадковується тільки по материнській лінії. По-друге, вважають, що трансгенні рослини з вбудованими «інсек- тицидними» генами, здатні спровокувати у комах-шкідників виник- нення масової резистентності. Тут також запропоновані дієві способи для зменшення цієї небезпеки, наприклад, використання генів декількох різних токсинів і/або індуцибельних промоторів, що швидко активують- ся при нападі комах на рослину. По-третє, вважають, що пилок трангенних рослин може бути ток- сичним і для корисних комах, які даним пилком харчуються. Деякі експериментальні дані говорять про те, що така небезпека дійсно існує, хоча про її можливі масштаби говорити поки важко. Проте і тут вже за- 82 пропоновані і випробувані адекватні генно-інженерні рішення, напри- клад, використання трансгенозу через хлоропластну ДНК, або промото- рів, що не працюють в пилку. 3.3. Трансгенні тварини: технології одержання На відміну від рослин, де існує можливість отримання цілої ферти- льної рослини з однієї трансформованої соматичної клітини, одержання трансгенних тварин – дуже складний і тривалий процес. Стратегія, що використовується при цьому полягає в наступному: 1. Клонований ген вводять в ядро заплідненої яйцеклітини. 2. Запліднені яйцеклітини з екзогенної ДНК імплантують в реципієнтну жіночу особину (оскільки успішне завершення розвитку ембріона ссавців в інших умовах неможливо). 3. Відбирають нащадків, які розвинулися з імплантованих яйцеклітин, що містять клонований ген у всіх клітинах. 4. Схрещують тварин, які несуть клонований ген в клітинах зародкової лінії і отримують нову генетичну лінію. Експерименти по генетичній модифікації багатоклітинних організ- мів шляхом введення в них трансгенів вимагають багато часу. Тим не менш, трансгеноз став потужним інструментом для дослідження моле- кулярних основ експресії генів ссавців і їх розвитку, для створення моде- льних систем, що дозволяють вивчати хвороби людини, а також для ге- нетичної модифікації клітин молочних залоз тварин з метою отримання з молоком важливих для медицини білків. Був навіть запропоновано но- вий термін «фармінг» (pharming), що відноситься до процесу отримання з молока трансгенних домашніх тварин білків людини або фармацевтич- них препаратів. Використання молока доцільно тому, що воно утворю- ється в організмі тварини у великій кількості і його можна надоювати у міру потреби без шкоди для тварини. Незважаючи на те, що перші трансгенні сільськогосподарські тварини були отримані в 1985 р. введенням екзогенної ДНК в пронуклеус зигот, до теперішнього часу не розроблено ефективного методу, який би міг бути використаний для створення генетично модифікованих тварин незалежно 83 від виду та від цілей експерименту. Розробка нових ефективних методів переносу генів у ембріональні і соматичні клітини тварин, а також вдоско- налення існуючих підходів залишається актуальним завданням. Знаменита овечка Доллі була клонована у 1997 р. шляхом перене- сення ядер трансформованих генеративних і соматичних клітин в яйце- клітину (соматичне ядерне перенесення). Це досягли шляхом злиття ку- льтивованих клітин епітелію молочної залози (вимені) дорослої шести- річної тварини з позбавленою ядра яйцеклітиною. Основна проблема, яку потрібно вирішити для того, щоб створення будь-яких трансгенних тварин за допомогою методу переносу ядер стало реальним – це збереження плюрипотентності клітин в безперервній ку- льтурі. В даний час ведуться активні пошуки факторів репрограмування диференційованих клітин для індукції плюрипотентності. Незважаючи на розроблений широкий спектр методик одержання трансгенних тварин, у даний час поки відсутня надійна і ефективна тех- нологія трансгенозу тварин. Найбільші проблеми пов’язані з безладним вбудовуванням екзогенної ДНК в геном при використанні більшості іс- нуючих методів. Яйцеклітина Упітелій молочної залози Клонована вівця Мікро- піпетка Вирощування клітин в культурі Видалення Індукція G0 ядра фази Імплан- Злиття тація Активація Культивування Сурогатна мати Рис. 9. Клонування вівці методом перенесення ядра. Епітеліальні клітини молочної залози в культурі індукують для переходу у фазу G0 (стадія, на якій знаходиться яйце- клітина). Потім здійснюють злиття такої клітини з енуклейованою яйцеклітиною (без ядра) і вирощують ембріони до ранніх стадій ембріогенезу. Після цього ембріони імплантують в матку сурогатної матері, де відбувається подальший розвиток. В експерименті Я. Уілмут (I. Wilmut) з клонування Доллі було проведено 277 злиттів без’ядерних яйцеклітин з клітинами молочної залози у фазі G0, з 29 ембріонів, що ви- жили тільки один розвинувся до життєздатного організму 84 3.4. Застосування трансгенних тварин Застосування трансгенних тварин можна розділити на п’ять основ- них категорій:  наукові моделі;  моделі для вивчення хвороб людини;  джерела для виробництва фармацевтичних препаратів;  джерела ксенотрансплантатів;  джерела їжі. Більшість з областей комерційного застосування трансгенних тва- рин в даний час знаходяться на ранніх етапах досліджень і розробки, за деякими винятками. Важливою віхою в історії застосування трансгенних тварин став 2006 р., коли Європейське медичне агентство видало перший дозвіл на комерційне використання першого рекомбінантного білка з молока тра- нсгенних тварин. Ним став рекомбінантний антитромбін III (з комер- ційною назвою ATryn), який призначений для профілактичного ліку- вання пацієнтів з вродженою антитромбіновою недостатністю. Наукові моделі. Трансгенна технологія несе в собі великі можливості, в першу чергу, для фундаментальних досліджень принципів функціонування геномів і окремих генів. Регульовані системи експресії трансгенів дають можли- вість досліджувати тонкі механізми впливу продуктів того чи іншого ге- на на фізіологію і ембріональний розвиток тварин. Модельні системи для вивчення хвороб людини. Використовуючи цілих тварин, можна моделювати виникнення пато- логії, досліджувати її розвиток і способи лікування. І хоча дані, отримані на трансгенних моделях, не завжди можна екстраполювати на людину в ме- дичних аспектах, вони дозволяють виявити ключові моменти етіології складної хвороби, її молекулярні основи і підказати шляхи лікування. В даний час на мишах змодельовані такі захворювання людини, як СНІД, хвороба Альцгеймера, артрит, м’язова дистрофія, гіпертонія, утво- рення пухлин, нейродегенеративні порушення, дисфункція ендокринної 85 системи, серцево-судинні захворювання та багато інших. Отримана дро- зофіла з хворобою Паркінсона. Джерела для виробництва фармацевтичних білків. Існуючі методи отримання в культурах клітин рекомбінантних люд- ських протеїнів для медичних цілей мають ряд істотних недоліків і жор- стких законодавчих обмежень. Однією з особливостей таких медичних препаратів є їх украй висока ціна, обумовлена в тому числі високою вар- тістю клітинного культивування. Долаючи ці обмеження, велика кіль- кість білків можна отримувати з молока трансгенних тварин, що несуть людські гени, відповідальні за вироблення певного протеїну, під контро- лем промоторів, специфічних для молочних залоз. В даний час численні білки отримані в великих кількостях ефективною секрецією в молоко трансгенних мишей, кроликів, овець, свиней, кіз і корів. Першим препа- ратом з молока став ATryn (людський антитромбін III), призначений для профілактичного лікування пацієнтів з вродженою антитромбіно- вою недостатністю), який в 2006 р. після 3-ї фази клінічних випробувань був зареєстрований як ліки в Європейському союзі. Успішна реєстрація препарату ATryn продемонструвала правильність такого підходу до продукції терапевтичних білків і полегшила шлях на ринок іншим реко- мбінантним препаратам з молока трансгенних тварин, а також стимулю- вала наукову і комерційну активність в даній області. Іншим джерелом продукції рекомбінантних білків є кров трансген- них тварин. Отримані трансгенні бички, які продукують біспецифічні ан- титіла людини в своїй крові. Ці антитіла після очищення з сироватки бу- ли дуже стабільні і відповідним чином стимулювали Т-клітинне знищен- ня ракових клітин. Отримання трансгенних курчат відкрило можливість використову- вати яйця, що містять чимало запасних білків для накопичення потріб- них рекомбінантних білків – активних компонентів лікарських засобів. У цьому випадку білки можна отримувати у великих кількостях, і їх вироб- ництво буде дешевим, так як сировиною для цього є всього лише пташи- ний корм. На сьогодні вже отримано дозвіл на клінічні випробування препарату проти раку на основі курячих яєць. 86 Трансгенні тварини як джерела ксенотрансплантатів для людини. Дефіцит людських органів для трансплантації змушує вчених шука- ти інші альтернативні джерела тканин. Так, станом на 2006 р. у США 80 тис. чол. потребували пересадки органів. Вирішенням цієї проблеми могла б бути пересадка людині органів тварин. Так, наприклад, органи свині підходять людині за своєю будо- вою, розміром і багатьма біохімічним показникам, але такі пересадки неможливі, оскільки ці органи будуть негайно відторгнуті імунною сис- темою пацієнта. В даний час ряд дослідницьких центрів працюють над виведенням генетично модифікованих свиней, органи яких можуть бути використані для трансплантації. Необхідними умовами для успішної ксенотрансплантації є: 1) подолання імунологічних бар’єрів (гістосумісності); 2) недопущення переносу патогенів від донорної тварини людині; 3) анатомічна і фізіологічна сумісність донорного органу з людським. За допомогою соматичного ядерного переносу отримані тварини, у яких супресований поки перший імунологічний бар’єр – реакція відтор- гнення негайного типу (гіперактивне відторгнення). Перші експери- менти по пересадці свинячих трансгенних нирок і серця нелюдиноподіб- ним приматам (павіани) з імунною супресією показали відсутність реак- ції відторгнення негайного типу, але виживаність пересаджених органів становила всього 2-6 місяців. Роботи по отриманню свиней-ксенотрансплантерів з множинними трансгенами, критичними для подолання інших імунологічних бар’єрів, тривають. Однак, незважаючи на багаторічні дослідження, пересадка людині органів свині все ще є віддаленим проектом. Трансгенні тварини, як джерело їжі. Ці тварини ще дуже далекі від комерційного використання, хоча створено вже багато різних варіантів. Наприклад, в геном свиней вдалося вбудувати декілька прискорюючих ріст генів, які також впливають на як- ість м’яса, роблячи його більш пісним і ніжним. Ця робота розпочата бі- льше 10 років тому, проте в силу певних негативних морфологічних і фі- зіологічних змін, що спостерігалися у тварин, цей варіант не був комер- ціалізований. 87 Запропоновано також велику кількість модифікацій молока великої рогатої худоби, що полягають у додаванні нових білків або в маніпуляці- ях над ендогенними протеїнами. Наприклад, були створені тварини, які продукують молоко для дитячого харчування, за своїм складом макси- мально наближене до материнського молока людини. Учені з Нової Зеландії отримали корів з підвищеним вмістом в моло- ці казеїну. Використання такого молока повинно підвищити продуктив- ність сироваріння виробництва. Ще кілька груп дослідників працюють над зниженням вмісту в мо- лоці лактози. Кінцевою метою є створення молока, придатного для вжи- вання в їжу людьми з лактозною непереносимістю. Поки ближче всіх на шляху до комерціалізації знаходяться фітазні трансгенні свині (екосвині), метою створення яких було різке зменшен- ня гнойового забруднення навколишнього середовища. Ця лінія несе ген бактеріальної фітами, яка дозволяє свиням розщеплювати рослинні фі- тати (інозитолгексафосфат – найбільш поширену нерозчинну форму ор- ганічного фосфору грунту), що зменшує вихід забруднюючих навколиш- нє середовище фекальних токсичних сполук фосфору (до 75%). З підвищенням потреби в рибопродуктах ГМ-риба може набути ве- лике значення як продукт харчування. Найбільш ймовірно, що першою ГМ-твариною на продовольчому ринку стане швидкоростуча сьомга (Salmo salar), в геном якої вбудований ген гормону росту чавичі (Oncorhynchus tschawytscha). Така сьомга росте в 3-4 рази швидше нетра- нсгенних аналогів, що значно зменшує час вирощування. Ген гормону росту також вбудували в геноми таких риб, як білий амур, райдужна форель, тіляпія і сом. У всіх випадках трансгени виділяли з геномів риб інших видів. Трансгенні домашні улюбленці. Поки що найуспішнішим випад- ком комерціалізації трансгенних тварин можна вважати декоративних рибок. Трансгенна акваріумна рисова рибка Oryzias latipes, яскраве зеле- не забарвлення якої обумовлено вбудованим геном зеленого флуоресце- нтного білка з медуз, просувається на ринок тайванською компанією Taikong. 88 Під торговою маркою GloFish в США продаються різнокольорові ри- бки-зебри Danio rerio, зафарбовані флуоресцентними білками коралів. При відповідному освітленні червоні, зелені і жовті рибки починають яс- краво світитися, хоча природне забарвлення D. rerio сірого кольору. У Європі, Канаді і Австралії трансгенні рибки заборонені, мабуть, внаслідок загальних упереджень проти трансгенних тварин. 4. ГЕНОТЕРАПІЯ Лікування захворювань за допомогою генів отримало назву геноте- рапії. Це вид лікування, який передбачає зміну або заміну генів у клітинах людини для лікування або запобігання захворюванням. Генотерапія пе- редбачає додавання нових функціонуючих генів у клітини, які були відсут- ні або несправні, або шляхом інактивації чи відновлення наявних генів. Гени можуть бути доставлені до клітин різними способами, включа- ючи вірусні вектори (трансдукція), які є спеціальними вірусами, що були модифіковані для перенесення нового гена в клітини, і невірусні методи (трансфекція), такі як електропорація чи пряме введення ДНК. Редагування генів є перспективним підходом до зміни геному лю- дини для лікування генетичних хвороб, серцево-судинних патологій, ві- русних захворювань, онкологічних патологій та хвороб асоційованих з віком. Активно досліджується генотерапія неврологічних хвороб, когні- тивних дисфункцій та наслідків травм нервової системи, а також в реге- неративній медицині. Практично в будь-якій області медицини або початі клінічні випро- бування лікування спадкових захворювань за допомогою генотерапії, або в дослідах на тваринах розробляються підходи до такого лікування. У мі- ру удосконалення методів доставки генів і контролю їх експресії список захворювань, до яких можна застосовувати генотерапію, безумовно роз- ширюватиметься. Історично генна терапія націлювалась на лікування спадкових гене- тичних захворювань, проте поле її застосування, принаймні теоретично, розширилося. В наш час генну терапію розглядають як потенційно уні- 89 версальний підхід до лікування широкого спектра захворювань, почина- ючи від спадкових, генетичних і закінчуючи інфекційними. Величезні перспективи відкриває використання генотерапії для лі- кування онкологічних захворювань. Багаторічні зусилля учених привели до розуміння того, що рак – це генетичне захворювання і його розвиток відбувається багатостадійно, в результаті серії генетичних порушень, що накопичуються в клітині. Методи генної терапії дозволяють лікувати різні генетичні патології в період внутрішньоутробного розвитку. Генна терапія успішно застосовується для лікування мультифакто- ріальних хвороб (діабет, остеопороз, ревматоїдний артрит). Для ліку- вання таких захворювань застосовується не одна, а відразу багато гене- тичних конструкцій, що виправляють дефекти різних стадій перебігу па- тологічного процесу. Історія розвитку генотерапії. Одним із найперших успішних прикладів було використання генної терапії для лікування важкого комбінованого імунодефіциту (ВКІД), рід- кісного та часто смертельного генетичного розладу, який впливає на імунну систему. У 1990 році група дослідників з Національного інституту здо- ров’я провела перше успішне випробування генної терапії ВКІД, під час якого вони використовували генетично модифікований вірус для доста- вки здорових копій гена, якого не було у пацієнтів із ВКІД, до клітин кіс- ткового мозку. Ця генна терапія призвела до вироблення функціональ- них імунних клітин у пацієнтів, що призвело до значного покращення їх- ніх симптомів і нормалізації функції їхньої імунної системи.  Перша комерційна генна терапія, Gendicine, була схвалена в Китаї у 2003 році для лікування деяких видів раку. Gendicine – це препарат для ген- ної терапії, який використовується для лікування пацієнтів із плоскок- літинним раком голови та шиї, пов’язаним із мутаціями в гені TP53.  У 2006 році була перша демонстрація ефективної боротьби з раком з використанням генної терапії. Вчені з National Institutes of Health (Ме- ріленд) успішно побороли метастазуючу меланому у двох пацієнтів, використовуючи генетично змінені Т-кілери. Колектив вчених на чолі з Luigi Naldini і Brian Brown з Міланського San Raffaele Telethon Institute 90 for Gene Therapy (HSR-TIGET) повідомив про прорив в генотерапії: ро- зроблений спосіб «обману» імунної системи, що викликає відторг- нення генно-модифікованих клітин. Для цього специфічним чином використовується мікроРНК (некодуючі РНК). Відкриття може зігра- ти ключову роль в розробці методів генної терапії гемофілії.  У травні 2007 року Moorfields Eye Hospital і University College London’s Institute of Ophthalmology оголосили про перше випробування генотера- пії для лікування вродженого амаврозу Лебера (спадкове захворювання сітківки). Перша операція була виконана на 23-річному британці Робе- рту Джонсону на початку 2007 року. Лікування призвело до позитивних результатів, при цьому не було виявлено ніяких побічних ефектів.  У грудні 2008 року успішно завершилися випробування на мишах те- рапії серпоподібно-клітинної анемії.  У 2009 році генотерапія успішно була застосована для поліпшення стану хворих на ВІЛ і ВКІД (важкий комбінований імунодефіцит). На гризунах показана ефективність генотерапії в терапії хронічного бо- лю та деяких видів глухоти і сліпоти.  У 2010 році опубліковано статтю, в якій описана технологія генної те- рапії для лікування форм ахроматопсії у собак. Ахроматопсія або повна колірна сліпота, використовується у вигляді ідеальної моделі для роз- робки методів генної терапії, спрямованих на конусні фоторецептори.  У 2012 році вчені з іспанського Національного онкологічного науко- вого центру (Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas, CNIO) під керівництвом його директора Марії Бласко довели, що тривалість життя мишей можна збільшити однократним введенням препарату, що безпосередньо впливає на гени тварини в дорослому стані. Вони зробили це за допомогою генної терапії – стратегії, яка ще жодного разу не використовувалася для боротьби зі старінням.  У листопаді 2012 року Єврокомісія вперше дозволила випуск і продаж в ЄС ліки нідерландської компанії UniQure – Glybera – на основі генотера- пії для лікування важкого генетичного захворювання – ліпопротеїнолі- пазної недостатності. Вартість ліків складала 1,6 млн доларів США, що на той час було рекордом за всю історію медицини. Однак, на жаль, че- рез високу ціну, ліцензію на препарат більше не було продовжено. Ліки 91 отримали лише 31 людина в усьому світі, більшість із яких пройшли безкоштовне лікування під час клінічних випробувань.  У 2016 році було схвалено препарат Strimvelis показаний для ліку- вання людей із тяжким комбінованим імунодефіцитом через дефіцит аденозиндезамінази.  У 2017 році схвалено препарат Kymriah для лікування B-клітинного гострого лімфобластного лейкозу, який використовує власні Т-клітини організму для боротьби з раком.  У 2017 році схвалено препарат Luxturna для лікування вродженого амаврозу Лебера (спадкова хвороба сітківки).  У 2018 році було схвалено Onpattro (Патісіран) – синтетичний лікарський препарат олігонуклеотидної природи, який пригнічує синтез білка тран- стиретину шляхом РНК-інтерференції. Розроблений для лікування рід- кісного спадкового захворювання – спадкової амілоїдної полінейропатії.  У 2019 році було схвалено Zolgensma – перший лікарський препарат для генної терапії спінальної м’язової атрофії. Золгенсма занесена в Книгу рекордів Гіннеса як найдорожчі ліки в світі (його вартість 2,125 млн. доларів).  У 2020 році групою вчених була проведена генотерапія для омоло- дження та відновлення нервового волокна сітківки. Старим мишам ввели за допомогою аденовірусу гени, які синтезують фактори Яма- накі, які епігенетично омолоджують клітини. Таке омолодження клі- тин дозволило відновити штучно пошкоджений оптичний нерв – не- рвові волокна бувально виросли знову.  У 2022 році завдяки новій формі редагування генів молода дівчина у Великій Британії, хвора на лейкемію, була вилікована за 6 місяців. Ре- дагування основи та мультиплексування можуть забезпечити більш ефективне лікування CAR-T для пацієнтів з невиліковними раковими захворюваннями.  У 2022 році голландські вчені з Інституту Губрехта, UMC Utrecht та Oncode Institute використали іншу форму редагування генів – первинне редагування – для виправлення мутації CRISPR, яка спричиняє муковіс- цидоз у стовбурових клітинах людини. Крім того, корейські дослідники з Університету Йонсей успішно використовували первинне редагуван- ня для лікування захворювань печінки та очей у дорослих мишей. 92  Також у 2022 році регулятори схвалили кілька знакових клітинних і генних терапій, зокрема Roctavian для лікування гемофілія А, та Hemgenix для лікування гемофілії В, Zyntelgo для бета-таласемії, Skysona для церебральної адренолейкодистрофії, Yescarta і Breyanzi для неходжкінської лімфоми, Tecartus для мантійно-клітинної лімфо- ми, Adstiladrin, для лікування раку сечового міхура, а також Carvykti і Abecma для множинної мієломи.  У 2023 році FDA (Управління їжі та ліків) схвалило першу генну тера- пію м’язової дистрофії Дюшена – Elevidys (Sarepta Therapeutics). Методи генотерапії. Методи генної терапії соматичних клітин можна поділити на дві ве- ликі категорії:  генна терапія ex vivo (поза тілом).  генна терапія in vivo (всередині тіла). Обидва типи генної терапії використовують вектор, або молекулу- носій для гена. Вектор допомагає включити потрібний ген в ДНК пацієн- та. Зазвичай цим вектором є модифікована вірусна ДНК, в якій були ви- далені вірусні гени. КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Які міжнародні регулюючі акти з біобезпеки біотехнології, зокрема генної інженерії ви знаєте? 2. Проаналізуйте можливі наслідки впливу ГМО на здоров’я людини. 3. Проаналізуйте можливі наслідки впливу ГМО на довкілля. 4. Які, на вашу думку, ризики, пов’язані із біотехнологіями є найбільш непередбачуваними? Обґрунтуйте відповідь. 5. У чому полягає загроза біотехнологій для збереження видового різ- номаніття. 6. Яким чином можна використати надбання генетичної інженерії для усунення екологічної кризи? 7. Назвіть області застосування генної інженерії рослин і тварин. 8. Що таке генотерапії? Які успіхи у її розвитку? 93 ТЕХНОЛОГІЧНА БІОНЕРГЕТИКА І БІОЛОГІЧНІ ПРОЦЕСИ ПЕРЕРОБКИ МІНЕРАЛЬНОЇ СИРОВИНИ ПЛАН 1. Біотехнологія у вирішенні енергетичних проблем. Отримання біогазу, спирту із промислових і сільськогосподарських відходів. 2. Біогеотехнологія металів. 3. Використання мікроорганізмів у процесах видобутку корисних копа- лин. 1. БІОТЕХНОЛОГІЯ У ВИРІШЕННІ ЕНЕРГЕТИЧНИХ ПРОБЛЕМ. ОТРИМАННЯ БІОГАЗУ, СПИРТУ ІЗ ПРОМИСЛОВИХ І СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ ВІДХОДІВ Особливо актуальною в останні два десятиліття стала необхідність розробки нових і ефективних способів виробництва енергетичних носіїв та поповнення сировинних ресурсів. У цьому зв’язку стали інтенсивно розвиватися нові розділи біотехнології – біоенергетика і біогеотехно- логія металів. За історію розвитку людського суспільства споживання енергії в ро- зрахунку на одну людину зросла більш ніж у 100 разів. Через кожні 10-15 років світовий рівень споживання енергії практично подвоюється, при цьому запаси традиційних джерел енергії – нафти, вугілля, газу висна- жуються. Крім того, спалювання викопних видів палив призводить до нарос- таючого забруднення навколишнього середовища. Тому стає дуже важ- ливим отримувати енергію в екологічно чистих технологіях. Невичерпним джерелом енергії на Землі є Сонце. Кожен рік на пове- рхню Землі з сонячною енергією надходить 3х2024 Дж енергії. У той же 94 час розвідані запаси нафти, вугілля, природного газу та урану, за оцінка- ми, еквівалентні 2,5х1022 Дж. Тобто менш ніж за один тиждень Земля отримує від Сонця таку ж кількість енергії, яка міститься у всіх запасах. Щорічно в процесах фотосинтезу утворюється понад 170 млрд т сухої ре- човини, а кількість енергії, зосередженій у ній, більш ніж в 20 разів пере- вищує сьогоднішнє річне енергоспоживання. Тобто у глобальному масштабі сонячна енергетика здатна забезпе- чити сучасний і майбутній рівень енерговитрат людства. Сьогодні у перспективі розглядається можливість засвоєння соняч- ної енергії, падаючої на пустелі. Її величина становить близько 5х1018 кВт/год. При освоєнні цієї енергії хоча б з 5%-м ККД рівень світо- вого виробництва енергії можна збільшити більш ніж в 200 разів. Таким чином, при можливому народонаселенні в 10 млрд людей одержання енергії тільки з поверхні зони пустель буде в 10-12 разів перевищувати енергетичні потреби людства. Принципово можливе також освоєння сонячної енергії, падаючої на поверхні морів і океанів. При цьому в первинному процесі перетворення сонячної енергії відбувається за рахунок синтезу біомаси фітопланктону; вторинний процес являє собою конверсію біомаси в метан і метанол. Плантації мікроводоростей за оцінками фахівців являють собою най- більш продуктивні системи: 50-100 т / га в рік. Перетворення біомаси сухої речовини в енергію здійснюється в проце- сі згорання, в результаті якого виділяється тепло, що перетворюється далі в механічну або електричну енергію. Сира біомаса також може бути пере- творена в енергію в процесах біометаногенезу і отримання спирту, що гру- нтуються на поєднанні фотосинтезу, тваринництва, кормовиробництва та ферментації з використанням тих чи інших біологічних агентів. Тобто, найбільш ефективні і обнадійливі для великомасштабного перетворення сонячної енергії – методи, засновані на використанні біо- систем. 95 1.1. Біометаногенез Біометаногенез або метанове «бродіння» – давно відомий процес перетворення біомаси в енергію. Відкрито даний процес в 1776 році Во- льтою, який встановив наявність метану в болотному газі. Біогаз, одер- жуваний з органічної сировини в ході біометаногенезу в результаті роз- кладання складних органічних субстратів різної природи, являє собою суміш з 65-75% метану і 20-35% вуглекислоти, а також незначних кіль- костей сірководню, азоту, водню. 1 м3 біогазу еквівалентний 4 кВт/год електроенергії; 0,6 л гасу; 1,5 кг вугілля і 3,5 кг дров. Неочищений біогаз використовують у побуті для обігріву помешкань і приготування їжі, а також застосовують в якості палива в стаціонарних установках, що виро- бляють електроенергію. Після попереднього очищення біогаз можна ви- користовувати в якості пального для двигунів внутрішнього згорання. Очищений біогаз аналогічний природному газу. У процесах біометаногенезу вирішується не тільки проблема відтво- рення енергії, а й екологічні проблеми, що дозволяють вирішувати про- блему утилізації та переробки відходів різних виробництв і технологій, сільськогосподарських і промислових, а також побутових, включаючи стічні води і тверді побутові відходи міських звалищ. У складних процесах деструкції органічних субстратів і утворення метану бере участь мікробна асоціація різних мікроорганізмів. В асоціації присутні 1) мікроорганізми-деструктори (представники родів Enterobacteriaceae, Lactobacilaceae, Streptococcaceae, Clostridium, Butyrivibrio, а також це- люлозоруйнуючі мікроорганізми, оскільки до процесу біометаногене- зу залучаються рослинні біомаси, що характеризуються високим вмі- стом целюлози), що викликають гідроліз складної органічної маси з утворенням органічних кислот (масляної, пропіонової, молочної), а також нижчих спиртів, аміаку, водню; 2) ацетогени, що перетворюють ці кислоти в оцтову кислоту, водень і окиси вуглецю; 3) метаногени – мікроорганізми, що відновлюють воднем кислоти, спирти і оксиди вуглецю в метан. 96 Метаноутворюючі бактерії виділені і описані зовсім недавно (в сере- дині 80-х років), вони досить широко поширені в природі в анаеробних зо- нах і разом з іншими мікроорганізмами беруть активну участь в деструкції органічних речовин з утворенням біогазу, в морських осадах, болотах, річ- кових і озерних мулах. До теперішнього часу виділено в чистій культурі та описано близько 30 метаноутворюючих бактерій; список цей безперервно поповнюється. Найбільш вивчені Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkerii, Methanobrevibacter ruminantium. Особливість мета- ноутворюючих бактерій – здатність активно розвиватися в тісному симбіо- зі з іншими групами мікроорганізмів, що забезпечують метаногени умова- ми та субстратами для утворення метану. У процесах метаногенезу можна переробити найрізноманітнішу си- ровину – різну рослинну біомасу, включаючи відходи деревини, неїстівні частини сільськогосподарських рослин, відходи переробної промислово- сті, спеціально вирощені культури (водяний гіацинт, гігантські бурі во- дорості), рідкі відходи сільськогосподарських ферм, промислові і побуто- ві стоки, мул очисних споруд, а також сміття міських звалищ. Важливо, що сировина з високим вмістом целюлози, що важко піддається методам переробки, також ефективно зброджується і трансформується в біогаз. Установки для біометаногенезу з урахуванням їх обсягів і продукти- вності можна підрозділити на кілька категорій:  реактори для невеликих ферм сільській місцевості (1-20 м3),  реактори для ферм розвинених країн (50-500 м3),  реактори для переробки промислових стоків (спиртової, цукрової промисловості) (500-10 000 м3)  реактори для переробки твердого сміття міських звалищ (1-20х106 м3). Метанотенки, виготовлені з металу або залізобетону, мають різно- манітну форму, включаючи кубічну і циліндричну. Існує величезна різноманітність установок для реалізації процесу ме- таногенезу, конструкційні деталі і компоновка яких визначається пріори- тетністю завдання, розв’язуваної в конкретному процесі: або це утилізація відходів і очищення стоків, або одержання біогазу необхідної якості. Так, серед діючих в розвинених країнах установок є як середні, так і великі за 97 обсягами апарати (дайджестери), забезпечені пристроями для очищення і накопичення біогазу, електрогенераторами і очисниками води. Такі уста- новки можуть входити до складу комплексів з промисловими підприємст- вами (цукропереробних, спиртових, молокозаводів), каналізаційними ста- нціями або великими спеціалізованими фермами. Коли головна мета про- цесу – утилізація відходів, у складі установок повинен бути присутнім блок для фракціонування і відділення великих твердих частинок. Найпростіша конструкція метанотенка – це звичайна бродильна яма в грунті з фіксованим обсягом газу. Метанотенк являє собою герметичну ємність, частково занурену в землю для теплоізоляції і забезпечену при- строями для дозованої подачі і підігріву сировини, а також газгольде- ром – ємність змінного об’єму для збору газу. Дуже важливим у констру- кції метанотенків є забезпечення необхідного рівня перемішування ге- терогенного вмісту апарату. Разом з тим відомо, що максимальне виді- лення метану спостерігається в системах зі слабким перемішуванням. Тому на відміну від аеробних процесів, що вимагають інтенсивної аерації і перемішування, перемішування при метаногенезі головним чи- ном, повинно забезпечувати гомогенізацію маси, що бродить, перешко- джати осіданню твердих частинок і утворенню твердої плаваючої кірки. В залежності від типу вихідного матеріалу, зброджуваного в мета- нотенку, інтенсивність процесу, включаючи швидкість подачі і повноту переробки, а також склад утвореного біогазу істотно варіюють. При пе- реробці рідких відходів тваринницьких ферм співвідношення між твер- дими компонентами і водою в завантажуваній масі має становити приб- лизно 1:1, що відповідає концентрації твердих речовин від 8 до 11% за вагою. Суміш матеріалу зазвичай засівають ацетогенними і метаноутво- рюючими мікроорганізмами з відстою зброженої маси від попереднього циклу або іншого метанотенку. Температура і, отже, швидкість проті- кання процесу залежать від виду використовуваних метанових мікроор- ганізмів. Для термофільних організмів процес реалізується при 50-60 °С, для мезофільних – при 30-40 °С і близько 20 °С – для психрофільних ор- ганізмів. При підвищених температурах швидкість процесу в 2-3 рази вища в порівнянні з мезофільними умовами. Процеси, що протікають при метановому бродінні, ендотермічні і вимагають підведення енергії у вигляді тепла ззовні. Для підігріву зава- 98 нтажуваної сировини і стабілізації температури процесу на необхідному рівні зазвичай спалюють частину утвореного біогазу. В залежності від температури процесу кількість біогазу, що йде на обігрів процесу, може досягати 30% від обсягу одержуваного. Швидкість надходження сировини на переробку або час утримання сировини в апараті є важливими і контрольованими параметрами. Чим інтенсивніший процес бродіння, тим вища швидкість завантаження і менший час утримання. Однак важливою умовою стабільності процесу біометаногенезу, як і будь-якої проточної культиваційної системи, є зба- лансованість потоків субстрату зі швидкістю розмноження продуцента. Норми завантаження сировини в існуючих процесах метаногенезу коливаються в межах 7-20% обсягу субстрату від обсягу біореактора на добу. Циклічність процесу – 5-14 діб. Зазвичай час зброджування тварин- ницьких відходів становить близько двох тижнів. Рослинні відходи пе- реробляються довше (20 діб і більше). Найбільш важкі для переробки тверді відходи, тому їх переробка триваліша. В результаті модифікації та удосконалення процесу можна суттєво змінити швидкість протоку сировини через метанотенк. Циклічність процесу може бути скорочена до 5-15 годин при збільшенні швидкості завантаження до 150-400% від загального добового обсягу. Інтенсифіку- вати процес можна в результаті використання термофільних мікроорга- нізмів і підвищення температури процесу, але це вимагає відповідних додаткових енерговитрат. Ефективно також просторове розділення процесу відповідно до ха- рактерної для нього з точки зору хімізму процесу двохфазністю. Процес реалізується в двох з’єднаних послідовно реакторах. У пер- шому апараті відбувається процес анаеробного розкладання органіки з утворенням кислот, оксидів вуглецю та водню (кислотна стадія). Пара- метри процесу бродіння в апараті задаються на рівні, що забезпечує не- обхідний вихід кислот і рН культури не вище 6,5. Отримана бражка пос- тупає в другий апарат, в якому відбувається процес утворення метану. У такій системі можна незалежно варіювати умови ферментації (швидкість протоку, рН, температуру) в кожному апараті з урахуванням створення 99 оптимальних умов для розвитку мікроорганізмів деструкторів в першо- му і метаногенів – у другому. В цілому, застосування такої біосистеми до- зволяє інтенсифікувати процес в 2-3 рази. В залежності від типу сировини та інтенсивності процесу біометано- генезу вихід біогазу коливається від 300 до 600 м3 х т органічної маси при виході метану від 170 до 400 м3/т. Глибина переробки субстрату при цьому може складати від 20 до 70%. Утворений в процесах метаногенезу рідкий або твердий шлам виво- зиться на поля і використовується в якості добрив. Дане застосування обумовлене умовами метаногенерації, при якій патогенні ентеробактерії, ентеровіруси, а також паразитарні популяції (Ascaris lumbricoides, Ancylostoma) практично повністю гинуть. Твердий залишок процесу (або активний мул) може бути використаний також в якості вихідної сирови- ни для отримання ряду біологічно активних сполук в процесах хімічного гідролізу або мікробіологічного синтезу. Екологічна безпека застосування і калорійність біогазу в поєднанні з простотою технології його одержання, а також величезна кількість від- ходів, що підлягають переробці, – все це є позитивним чинником для по- дальшого розвитку і поширення біогазової промисловості. Поштовхом до створення даного ефективного біотехнологічного на- прямку послужила енергетична криза, що вибухнула в середині 70-х ро- ках. Виробництво біогазу стало одним з основних принципів енергетич- ної політики ряду країн Тихоокеанського регіону. Уряд Китаю приділив більше уваги і вклав багато коштів у становлення біогазової промисло- вості, особливо в сільській місцевості. В рамках національної програми були створені умови для появи мережі заводів, що випускають біогазові установки. Уряд заохочував цей напрямок і пішов навіть на створення мережі регіональних і місцевих контор, відповідальних за біогазову про- граму. Державні банки надавали населенню пільгові позики та матеріали для будівництва установок. І вже в 1978 році, через три роки після прий- няття програми в країні функціонувало понад 7 млн. установок, що в 15 разів перевершувало рівень 1975 році. У рік вироблялося близько 2,6 млрд. м3 біогазу, що еквівалентно 1,5 млн. т нафти. На початку 80-х років у Китаї вироблялося до 110 млрд. м3 біогазу, що еквівалентно 100 60-80 млн. т сирої нафти, а в середині – створено до 70 млн. установок, які приблизно у 70% селянських сімей покривали побутові потреби в енергії. В Індії також велику увагу було приділено отриманню енергії в про- цесах біометаногенезу при утилізації сільськогосподарських відходів. Будівництво біогазових установок почалося на Філіппінах, в Ізраїлі, краї- нах Латинської Америки. Інтерес до даної технології в середині 80-х ро- ків посилився також в країнах центральної Європи, особливо ФРН і Франції. У середині 90-х років в країнах Європейського економічного співтовариства функціонувало близько 600 установок з виробництва бі- огазу з рідких сільськогосподарських відходів і близько 20, що перероб- ляли тверде міське сміття. У передмістях Нью-Йорка установка з переро- бки вмісту міського звалища виробляє близько 100 млн м3 біогазу на рік. Інтегровані національні програми багатьох країн Африки і Латинської Америки, що мають величезні кількості сільськогосподарських відходів (понад 90% світових відходів цитрусових, бананів і кави, близько 70% відходів цукрового очерету і близько 40% відходів світового поголів’я худоби), в даний час орієнтовані на отримання біогазу. 1.2. Отримання спирту Отримання етилового спирту на основі дріжджів відомо з давніх ча- сів. В останні роки все більших масштабів набуває хімічний синтез ета- нолу з етилену, який конвертується в спирт при високій температурі в присутності каталізатора та води. Однак мікробіологічний синтез не втрачає актуальності. Перспективи використання нижчих спиртів (метанолу, етанолу), а також ацетону та інших розчинників в якості пального для двигунів вну- трішнього згоряння викликали в останні роки великий інтерес до мож- ливості їх великомасштабного отримання в мікробіологічних процесах з використанням різної рослинної сировини. Етиловий спирт є прекрас- ним екологічним чистим пальним для двигунів внутрішнього згоряння. Заміна дефіцитного бензину іншими видами пального – актуальна про- блема сучасності. Особливо гостро питання стоїть в країнах Америки та Західної Європи. Використання чистого етанолу або в суміші з бензином 101 (газохол) істотно знижує забруднення навколишнього середовища ви- хлопними газами, так як при згорянні етанолу утворюються тільки вуг- лекислота і вода. Тому в країнах з великими запасами природного рослинного матері- алу і відповідними грунтово-кліматичними умовами, що забезпечують великі щорічні урожаї, стає доцільним орієнтувати виробництво мотор- них палив на процеси мікробіологічного бродіння. В якості пального спирт почали застосовувати в США і Німеччині у 30-40 роках. Інтерес до спиртів в якості палива різко зріс в 70-ті роки. Наприклад, у Бразилії етанол використовують в якості палива в двигунах внутрішнього згоряння уже кілька десятиліть. У 1982 році почалося ін- тенсивне будівництво спиртових заводів за технологією шведської фір- ми «Альфа Ляваль» продуктивністю до 150 тис. л 95% спирту на добу на основі цукровмісної сировини. У Росії діють установки з виробництва гі- дролізного спирту технології Вніігідроліз. В Японії до кінця 90-х років експорт нафти було скорочено з 72 до 49% за рахунок отримання спирту на основі імобілізованих мікробних клітин. Сировиною для процесів спиртового бродіння можуть бути різнома- нітні біомаси, включаючи крохмалвмісні (зерно, картопля), цукровмісні матеріали (меляса, відходи деревопереробної промисловості), а також біомаса спеціально вирощених прісноводних і морських рослин і водоро- стей. Процес складається з декількох стадій, що включають підготовку сировини, процес бродіння, відгін і очищення спирту, денатурацію, пере- робку кубових залишків. Етиловий спирт зазвичай отримують з гексоз в процесах бродіння, що викликаються бактеріями (Zymomonas mobilis, Z. anaerobica, Sarcina ventriculi), клостридії (Clostridium thermocellum) і дріжджами (Saccharomyces cerevisiae): С6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2 Головне завдання, яке доводиться вирішувати при одержанні спир- тів технічного призначення, – це заміна дорогих крохмалвмісних субст- ратів дешевою сировиною нехарчового призначення. Процеси, що відбуваються при конверсії цукровмісного субстрату в спирт, включають також процеси метаболізму і росту клітин- 102 продуцента, тому в цілому біологічний процес отримання спиртів зале- жить від ряду параметрів (концентрації субстрату, кисню, а також кінце- вого продукту). При накопиченні спирту в культурі до певних концент- рацій починається процес інгібування клітин. Тому велике значення на- буває отримання особливих штамів, резистентних до спирту. Побічними продуктами спиртового бродіння є вуглекислота, сивуш- ні масла, кубові залишки, дріжджі. Кожен з цих продуктів має певну вар- тість і самостійну сферу застосування. Спроби вдосконалення процесу бродіння можливі в декількох на- прямках. Це перехід на безперервні процеси, отримання більш стійких до спирту штамів дріжджів і здешевлення вихідної сировини. Безперервні процеси зброджування дозволяють підвищити кінцеву концентрацію спирту до 12%. Отримано нові штами, в основному серед бактеріальних культур, стійкі до таких концентрацій спирту. До розробок останніх ро- ків відноситься напрям, заснований на використанні не вільних, а іммо- білізованих мікробних клітин. Іммобілізовані клітини, володіючи підви- щеною толерантністю до спирту, дозволяють вирішувати одночасно за- дачу оптимізації за двома параметрами: підвищувати повноту викорис- тання субстрату і кінцевий вихід спирту. Випуск спиртів в якості моторних палив передбачає великі обсяги їх виробництва. В якості вихідного субстрату для отримання технічного спирту економічно виправдано використання відходів цукрової трости- ни, а також маніоку, батату, солодкого сорго, тапінамбура. Однак ці куль- тури характерні для країн з теплим кліматом, наприклад Латинської Америки. Для регіонів з помірним кліматом, що мають великі масиви лі- сів, прийнятним виявляється використання гідролізатів відходів дере- вини. Але для цього потрібен досить енергоємний і дорогий процес руй- нування лігніну і целюлози з утворенням водорозчинних цукрів. Процес гідролізу безперервно удосконалюється. Для підвищення виходу цукрів в процесі гідролізу та зниження енерговитрат розробляються нові методи деструкції лігноцелюлози з залученням фізичних, хімічних, ферментати- вних методів, а також в їх поєднанні. Крім відходів лісопиляння та дере- вообробки, можливе залучення також соломи, торфу, очерету. 103 Екологічні переваги отримання та застосування етанолу як палива очевидні. Економічні ж визначаються низкою умов: кліматом і продук- тивністю зеленої біомаси, собівартістю сільськогосподарської продукції та наявністю (або відсутністю) енергоносіїв у вигляді нафти, природного газу або вугілля. 1.3. Рідкі вуглеводні Перші спроби пошуку серед фотосинтезуючих організмів потенційних продуцентів енергоносіїв у вигляді рідких вуглеводнів відносяться до 1978 року, коли дослідники намагалися виявити в соку деяких рослин, го- ловним чином у представників сімейства молочайних, рідкі вуглеводні. Однак спроби не увінчалися успіхом, так як концентрація вуглеводнів у вищих рослин виявилася вкрай низькою. Дещо пізніше вдалося встановити здатність до синтезу рідких вуглеводнів у водоростей і бактерій. Було показано, що у зеленої водорості Botryococcus braunii вміст вуг- леводнів може складати від 15 до 75% від суми ліпідів. Ця одноклітинна зелена водорість зростає у водоймищах з прісною і солонуватою водою в помірних і тропічних широтах. Дана водорість існує у двох різновидах: червона і зелена, оскільки хлоропласти цієї водорості мають різне забар- влення, обумовлену присутністю пігментів у вигляді хлорофілів всіх ти- пів, а також каротинів і їх окислених похідних (ксантофілів, лютеїну, не- оксантину, зеоксантину та ін.) У несприятливих умовах росту, виклика- них, наприклад, дефіцитом яких-небудь біогенів або підвищенням соло- ності середовища, співвідношення основних груп пігментів змінюється в бік домінування каротиноїдів, і тоді водорості набувають оранжево- червоне забарвлення. При дефіциті, наприклад іонів магнію в середовищі концентрація вуглеводнів в клітинній стінці досягає 70-75%. При цьому було виявлено, що зелена водорість синтезує лінійні вуглеводні з непар- ним числом вуглецевих атомів в ланцюгу (С25-С31) і бідним ненасиченими зв’язками. Червоний різновид синтезує лінійні вуглеводні з парним чис- лом вуглецевих атомів в ланцюгу (С34-С38) і з декількома ненасиченими зв’язками. Дані вуглеводні, «ботріококцени», накопичуються водорістю в ростовій фазі в клітинній стінці. Вилучити вуглеводні без руйнування 104 клітин можна центрифугуванням біомаси водорості, в ході якого вугле- водні «випливають» із клітин. Останні можна знову помістити з середо- вища в умови акумуляції вуглеводнів. Варіюючи умови росту, освітле- ність, температуру, концентрацію солей, дослідники з Французького ін- ституту нафти скоротили час подвоєння від семи до двох діб, при цьому вихід вуглеводнів становив 0,09 г / л на добу, що відповідає 60 т / га в рік. Фракція вуглеводнів, що синтезується водорістю, аналогічна гасу або дизельному паливу. Ця водорість, як виявилося, досить широко поширена в природі, зу- стрічається в різних місцях: від солонуватих озер Австралії до водосхо- вищ в околицях Лондона. В даний час визнано ефективним використання цих вуглеводнів у фармацевтичній промисловості. У США діє ферма для вирощування во- дорості B. braunii із сумарною площею водойми 52 тис. га. Продуктив- ність процесу отримання вуглеводнів становить до 4800 м3 на добу. 1.4. Біологічне отримання водню Проблема отримання водню – одна з основних проблем технічного прогресу ряду найважливіших промислових галузей, в тому числі енер- гетики. Водень розглядається як головний енергоносій майбутнього, ча- стково переважаючого основні сучасні енергоносії – нафту і природний газ. Теплотворна здатність водню досить висока (28,53 ккал/кг), це в 2,8 рази вище бензину. Водень легко транспортується і акумулюється в різних фазових станах; в газоподібному стані не токсичний, має високу теплопровідність і малу в’язкість в різних фазових станах. Але головна його перевага – екологічна чистота, єдиний побічний продукт його зго- ряння – вода. За прогнозами експертів, енергетична система майбутнього сторіч- чя буде «водневою», тобто буде заснована на застосуванні двох енерго- носіїв – електрики і водню, найбільш зручного для використання на тра- нспорті і в промислових технологіях. Створення майбутнього великомасштабного виробництва водню ставить перед наукою завдання пошуку найбільш економічних і екологі- 105 чних шляхів отримання водню з використанням таких джерел первинної енергії, як енергія розподілу важких елементів, термоядерного синтезу і сонячна. Проблема експлуатації сонячної енергії активно досліджується в даний час. Це пов’язано як із загрозою зменшення запасів палива, так і з все більш гострими питаннями захисту навколишнього середовища, так як паливна енергетика відіграє не останню роль в тепловому і хімічному забрудненні повітряного і водного басейнів. Кількість сонячної енергії, що падає на Землю, на багато порядків перевершує кількість всіх видів вторинної енергії. Тільки 0,1-0,2% соня- чної енергії поглинається зеленими рослинами і тільки 1% утворених в процесі фотосинтезу продуктів використовується людиною в їжу. Тому все більш вимогливо постає завдання більш ефективного використання енергії Сонця. Сучасна наука шукає вирішення даної задачі в багатьох, в тому числі і біологічних напрямках. Особливо перспективним представ- ляється отримання водню з використанням сонячної енергії з води, яка є найбільш дешевим і доступним субстратом. Запаси води в світовому оке- ані складають 1,3х1018 т, тобто досить значні. Отримання водню можливо в результаті електролізу води, а також термохімічного розкладання води з використанням відхідного тепла атомних станцій. Вода може піддаватися прямому фоторуйнуванню під впливом со- нячних променів: Н2О + hν → Н2 + 0,5 О2. Розробляються також способи одержання водню в результаті фото- хімічного розкладання води. В основі способу лежать реакції, в яких бере участь фотосенсибілізатор (А) і нечутливі до світла сполуки (В); процес протікає у водному середовищі: Н2О + А + В + hν → АН2 + ВО. Цикл замикається реакціями: АН2 → А + Н2, ВО → В + 0,5 О2. Порівняно недавно показана можливість отримання водню розкла- данням води за участю біокаталітичних агентів. Так, на початку 60-х років 106 було встановлено, що хлоропласти, виділені зі шпинату, в присутності штучного донора електронів і бактеріального екстракту, що містить фер- мент гідрогеназу, здатні продукувати водень. Через десятиліття дослідни- ки в США встановили, що хлоропласти шпинату і бактеріальні структури, що містять гідрогеназу і фередоксин в якості переносника електронів, піс- ля опромінення видимим світлом здатні утворювати водень. Роботи по створенню систем біофотолізу води проводяться досить активно в багатьох країнах. Це призвело до створення різних типів сис- тем. Ці системи, незалежно від природи складових її компонентів, по- винні мати два елементи: 1) електрон-транспортну систему фотосинтезу, що включає систему ро- зкладання води; 2) каталізатори утворення водню. В якості каталізаторів утворення во- дню можна використовувати як неорганічні каталізатори (металева платина), так і ферментативні (гідрогеназа). Система біокаталітичного отримання водню є поки єдиним прикла- дом одностадійної системи, здатної працювати в видимих променях сві- тла. Ця система надзвичайно цінна, оскільки працює на невичерпних джерелах енергії (сонячне світло) і сировини (вода) і виділяє при цьому екологічно чистий і висококалорійний енергоносій – водень. Інтенсивне вдосконалення таких систем буде важливим етапом в процесах перетво- рення сонячної енергії в водень. Перспективними, що розробляються напрямками є – отримання во- дню на основі зростаючих мікробних популяцій хемосинтезуючих і фото- синтезуючих організмів. Серед хемотрофних мікроорганізмів в якості продуцентів водню привертають увагу види, здатні рости на досить дос- тупних і дешевих субстратах. Наприклад, культура клостридій C. perfringens, зброджуючи різну органіку, здатна продукувати в 10-літровому апараті до 23 л Н2 / год. Створення великомасштабної сис- теми на такій основі не представляється важким, тому що вже розробле- ні і впроваджені в промисловість процеси отримання ацетобутилового бродіння з використанням клостридій. Більш перспективними продуцентами є фототрофні мікроорганізми, так як утворення ними водню пов’язане з процесами поглинання енергії 107 світла і, отже, може підвищити ефективність використання сонячної ра- діації. З найбільшою швидкістю водень виділяють деякі пурпурні бакте- рії, наприклад деякі штами Rh. capsulata, до 150-400 мл Н2/год х г сухої речовини. В якості субстратів пурпурні бактерії використовують різні органічні сполуки, які вони розкладають з утворенням вуглекислоти і водню. Наприклад, при розкладанні 1 г лактату пурпурні бактерії утво- рюють до 1350 л водню. Важлива здатність пурпурних бактерій проду- кувати водень при використанні, крім органічних сполук, також тіосуль- фату та інших відновлених сполук сірки. В якості субстрату можливе застосування також деяких відходів, включаючи гній. Ефективність продукції водню при цьому складає до 50 кг Н2/м2 х г. 2. БІОГЕОТЕХНОЛОГІЯ МЕТАЛІВ Біогеотехнологія металів – це процеси вилучення металів з руд, кон- центратів, гірських порід і розчинів під впливом мікроорганізмів або продуктів їх життєдіяльності при нормальному тиску і фізіологічній те- мпературі (від 5 до 90 °С). Складовими частинами біогеотехнології є: 1) біогідрометалургія, або бактеріальне вилуговування; 2) біосорбції металів з розчинів; 3) збагачення руд. Бактеріальне вилуговування. Важливість застосування біогеотехно- логії металів пов’язана з вичерпністю доступних природних ресурсів мі- неральної сировини і з необхідністю розробки порівняно небагатих і важкоперероблюючих родовищ. При цьому біологічні технології не за- бруднюють навколишнє середовище. Біогеотехнологічні методи, мікробіологічна адсорбція і бактеріальне вилуговування, дозволяють отримати додаткову кількість кольорових ме- талів за рахунок утилізації «хвостів» збагачувальних фабрик, шламів та ві- дходів металургійних виробництв, а також переробки так званих позаба- лансових руд, вилученням з морської води і стоків. Застосування біологіч- них методів інтенсифікує процеси видобутку мінеральної сировини, зде- 108 шевлює їх, при цьому виключає необхідність застосування трудомістких гірничих технологій; дозволяє автоматизувати процес. В даний час процес бактеріального вилуговування для одержання міді досить широкого застосовують повсюдно; менші масштаби має бак- теріальне вилуговування урану. У менших масштабах застосовується в гірничодобувній промислово- сті інший біотехнологічний процес – вилучення металів з водних розчи- нів. Цей напрямок обіцяє істотні перспективи, так як припускає досить дешеві процеси очищення стоків від металів і економічне одержання при цьому сировини. Незважаючи на давність існування біотехнологічних процесів вилу- чення металів з руд і гірських порід, тільки в 50-ті роки була доведена активна роль мікроорганізмів в цьому процесі. У 1947 році в США Колмер і Хінклі виділили з шахтних дренажних вод мікроорганізми, що окислю- ють двовалентне залізо і відновлюють сірку. Мікроорганізми були іден- тифіковані як Thiobacillus ferrooxydans. Незабаром було доведено, що ці залізоокислюючі бактерії в процесі окислення переводять мідь з рудних мінералів у розчин. Потім були виділені і описані багато інших мікроорганізмів, що бе- руть участь у процесах окислення сульфідних мінералів. Через кілька ро- ків, в 1958 році, в США був зареєстрований перший патент на отримання металів з концентратів за допомогою залізоокислюючих мікроорганіз- мів. Бактерії Thiobacillus ferrooxidans дуже широко поширені в природі, вони зустрічаються там, де мають місце процеси окислення заліза чи мі- нералів. Вони в даний час найбільш вивчені. Крім Thiobacillus ferrooxidans, широко відомі також Leptospirillum ferrooxidans. Порівняно недавно виді- лені і описані бактерії Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Thiobacillus thiooxidans, T. acidophilus. Для всіх цих мікроорганізмів процеси окислення неорганічних субс- тратів служать джерелом енергії. Сульфідні мінерали ефективно окислюються бактеріями при насту- пних умовах: мікроорганізми повинні бути адаптованими до умов конк- ретної породи, їх концентрація в середовищі повинна бути достатньо ви- сокою (1-5 г/л). Вилуговування проходить активніше, якщо руда попере- 109 дньо тонко подрібнена до частинок розміром близько 40 мкм (зазвичай пульпи містять твердої речовини до 20%) при безперервному перемішу- ванні і аерації, а також стабілізації рН і температури середовища на рівні, оптимальному для мікроорганізмів. Бактеріальне вилуговування в промислових масштабах досить ши- роко застосовують для переводу міді та урану в розчинну форму. Існують декілька способів проведення бактеріального вилуговування металів. Всі вони засновані на стимуляції росту залізоокислюючих бактерій, здатних окислювати двовалентне залізо і сірку. Ці методи дуже економічні і чисті в екологічному плані; відрізняються достатньою простотою і здатні до самопідтримуванню. Всі отримані при бактеріальному вилуговуванні продукти реакції перебувають в розчинах, які легко можна нейтралізувати; будь-які шкід- ливі побічні газоподібні продукти відсутні; процес не залежить від мас- штабів його проведення. До труднощів реалізації біологічних методів відноситься необхід- ність підтримання активної мікробної культури в строго контрольова- них і заданих умовах, найнижчі в порівнянні з хімічними процесами швидкості реакцій, взаємопов’язаність процесів вилуговування зі швид- костями росту мікроорганізмів. 3. ВИКОРИСТАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ У ПРОЦЕСАХ ВИДОБУТКУ КОРИСНИХ КОПАЛИН Поверхневе вилуговування куп і відвалів, в основному, зводиться до вилучення металів з відходів гірничодобувної промисловості або побіч- них бідних руд, переробка яких звичайними способами не економічна. Методи поверхневого вилуговування куп і відвалів застосовують за- звичай при витяганні міді з порід з низьким її вмістом (менше 0,4% за вагою). Такі відвали накопичуються у великих кількостях при великома- сштабній відкритій розробці руди, можуть займати величезні площі і до- сягати у висоту кількох сотень метрів. Найбільший відвал Бінгхем- Каньйон знаходиться в Америці та вміщує близько 3,6 х 108 т породи. 110 Вилуговування куп дещо відрізняється від вилуговування відвалів. Купи містять підвищений в порівнянні з відвалами вміст металу, вилу- чення якого в принципі можливе за досить короткий термін – кілька мі- сяців. У той же час вилуговування відвалів може тривати роками. У купах і відвалах подрібнена руда покладена на похилу водонепроник- ну основу. Поверхні куп і відвалів зрошуються рідиною, що представляє со- бою слабкий розчин кислоти та іонів тривалентного заліза. Збір розчину з витягнутим металом, профільтрований через шар породи, збирають знизу. Оскільки при вилуговуванні відвалів в середовищі, як правило, розвивають- ся природні мікроорганізми, засіву не здійснюють. Кисле середовище і ки- сень сприяють підвищенню каталітичної активності Thiobacillus ferrooxidans. Вилугувана рідина за допомогою насосів подається на верх купи руди, роз- порошується по її поверхні і потім, самопливом стікаючи вниз, фільтрується через неї. Збагачені металом розчини, що стікають з відвалів і куп, направ- ляються в спеціальні ставки і водойми для збору і вилучення металу. Вилучення проводять методом простого осадження або електролі- зом, а також більш складними методами. Відпрацьовані розчини, що міс- тять в основному розчинене залізо, регенеруються в окислювальних ста- вках і знову подаються у відвали. Швидкість вилучення металу при промисловому вилуговуванні куп і відвалів залежить від багатьох факторів – активності культури, якості руди і ступеня її дисперсності, швидкості фільтрації вилугованого роз- чину, аерації. Так, при введенні стисненого повітря в товщу вилугованої мідної руди швидкість вилучення міді зростає на 25%. У цілому в США 15% міді отримують у процесах бактеріального ви- луговування куп і відвалів. Істотно рідше мікроорганізми застосовують для вилуговування в промислових масштабах урану. Для цього порода або руда повинні бути багаті сульфідними мінералами і не надто інтенсивно поглинати кисень. У східних районах Канади підземне бактеріальне вилуговування застосо- вують для вилучення залишкового урану на вироблених майданчиках, для цього стінки і дахи вибоїв промивають підкисленою водою. Розви- ваються природні залізобактерії Thiobacillus ferrooxidans, які окислюють двовалентне залізо до тривалентного, яке окислює чотирьохвалентний уран до шестивалентного, переводячи його в розчин: 111 UO2 + Fe2 (SO4) 3 → UO2SO4 + 2 FeSO4. Можливе також пряме окислення урану бактеріями: 2 UO2 + O2 + 2 H2SO4 → 2 UO2SO4 + 2 H2O. Через 3-4 місяці забої знову промивають. Промивні води, що містять уран, збирають; уран вилучають розчинниками або за допомогою іонно- го обміну. Найбільш складний процес бактеріального вилуговування в апара- тах – так зване чанове вилуговування. Цей тип вилуговування застосо- вують в гірничорудній промисловості для видобування урану, золота, срібла, міді та інших металів. Звичайне виробництво більшості металів на початковій стадії передбачає концентрування металомісткого міне- ралу з руди. У концентратах вміст металів може на порядок перевершу- вати їх концентрації у вихідних рудах і породах. Біосорбції металів з розчинів. Сьогодні вкрай необхідним є вдосконалення існуючих та розробка нових, більш ефективних методів очищення води від металів. Біологічні методи в останні роки знаходять все більше застосування для вилучення металів з промислових, а також побутових стічних вод. Ці методи, на від- міну від дорогих фізико-хімічних, характеризуються достатньою просто- тою і ефективністю. Зазвичай для цих цілей забруднені металами води збирають у відстій- никах або ставках зі слабкою течією, де відбувається розвиток мікрооргані- змів і водоростей. Ці організми накопичують розчинені метали внутрішньо- клітинно або, виділяючи специфічні продукти обміну, переводять їх в не- розчинну форму і викликають осадження. Багато мікроорганізмів здатні на- копичувати метали у великих кількостях. У ході еволюції в них сформували- ся системи поглинання окремих металів і їх концентрування у клітинах. Мікроорганізми, крім включення в цитоплазму, здатні також сорбу- вати метали на поверхні клітинних стінок, зв’язувати метаболітами в не- розчинні форми, а також переводити в летючу форму. Селекція в цьому напрямку і застосування нових генноінженерних методів дозволяють отримувати форми, що активно акумулюють метали, і на їх основі ство- рювати системи біоочищення. 112 Ідея використання мікроорганізмів для вилучення металів з розчи- нів, крім величезного екологічного значення, важлива також в якості способу отримання економічно важливих металів. За допомогою біосорбції навіть з розбавлених розчинів можливе 100% вилучення свинцю, ртуті, міді, нікелю, хрому, урану і 90% – золота, срібла, платини, селену. Нещодавно встановлена здатність водоростей, дріжджів і бактерій (Pseudomonas) ефективно сорбувати уран з морської води. Способи проведення біосорбції різні: можливо пропусканням розчи- ну металів через мікробний біофільтр, що представляє собою живі клі- тини, сорбованих на вугіллі. Після концентрування металів мікрооргані- змами на наступній стадії метали вилучають з мікробної біомаси. Для цього існують різні способи – як недеструктивного, так і засновані на екстракції шляхом руйнування. Таким чином, біологічні методи активно доповнюють і частково до- зволяють замінити традиційні методи гірничодобувної галузі. Застосу- вання біотехнологічних методів дозволяє збільшувати сировинні ресур- си, забезпечує комплексне вилучення металів, не вимагає складної гір- ничої техніки; процеси легко піддаються регулюванню і автоматизації і дозволяють вирішувати багато природоохоронних завдань. КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Як вирішує енергетичні проблеми біотехнологія? 2. Отримання біогазу, спирту із промислових і сільськогосподарських відходів. 3. Що таке біометаногенез? 4. Як отримують спирт? 5. Рідкі вуглеводні, їх області застосування. 6. Опишіть біологічне отримання водню. 7. Що являє собою біогеотехнологія металів? 8. Як використовують мікроорганізми у процесах видобутку корисних копалин? 113 БІОТЕХНОЛОГІЯ ТА ПРОБЛЕМИ ЗАХИСТУ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА ПЛАН 1. Принципи біологічних методів аеробної та анаеробної переробки від- ходів. 2. Анаеробні процеси очищення стоків. 3. Аеробні процеси очищення стоків. 4. Застосування біотехнологічних методів для очищення газо- повітряних викидів і деградації ксенобіотиків. 1. ПРИНЦИПИ БІОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ АЕРОБНОЇ ТА АНАЕРОБНОЇ ПЕРЕРОБКИ ВІДХОДІВ Біотехнологія дозволяє вирішувати ряд екологічних проблем, включа- ючи захист навколишнього середовища від промислових, сільськогосподар- ських і побутових відходів, деградацію токсикантів, що потрапили в середо- вище, а також сама створює маловідходні промислові процеси одержання харчових і лікарських речовин, кормів, мінеральної сировини, енергії. Використання та отримання величезної кількості продуктів в різних сферах людської діяльності супроводжується утворенням стічних вод, забруднених різноманітними органічними і неорганічними, в тому числі токсичними сполуками. Стоки, що скидаються в природні водойми істотним чином вплива- ють на якість води, порушують біологічну рівновагу в водоймах, тим са- мим ускладнюють раціональне водокористування, а в окремих випадках повністю виводять водойми з ладу. Скидання неочищених стічних вод негативно позначається на вмісті у воді розчиненого кисню, її рН, прозо- рості і кольоровості і т.д. Все це негативно впливає на стан компонентів водної екосистеми, знижує продуктивність і здатність водойм до самоо- чищення. 114 Органічні речовини, що потрапили у водойми, окиснюються до СО2 і Н2О в межах здатності водойм до самоочищення. Кількість кисню, що ви- трачається в цих процесах – біологічне споживання кисню (БСК) (кіль- кість кисню, витрачена на аеробне біохімічне окислення під дією мікроор- ганізмів і розкладання нестійких органічних сполук, що містяться в дос- ліджуваній воді), визначається концентрацією і спектром присутніх у во- ді домішок. Розрізняють БСК5 (п’ятиденний), БСК20 (двадцятиденний) і БСКповн (повний). БСКповн означає час, протягом якого всі речовини стоків окислюються у водоймі повністю до кінцевих продуктів. Стічні води яв- ляють собою складні системи з комплексом речовин, їх БСК складає від 200 до 3000 мг О2/л. При скиданні у водойму таких стічних вод в неочи- щеному вигляді можливе повне витрачання запасів кисню. Тому перед скиданням стічних вод у природні водойми їх необхідно очищати до та- кої міри, при якій після скидання БСК залишається в межах санітарних норм (для джерел централізованого господарсько-питного водопоста- чання і водних об’єктів, які використовуються у рибогосподарських цілях, БСКповн не повинне перевищувати 3 мг/л). Очищення стічних вод – це система методів, що викликають руйну- вання або видалення з них присутніх речовин, а також патогенних мік- роорганізмів. У процесах природного самоочищення водойм у більшості випадків речовини, що надходять зі стоками піддаються руйнуванню. У ході цього процесу структура, властивості і концентрації речовин змі- нюються в часі і просторі. В результаті вода набуває початкові властиво- сті. Таким чином, водойми відіграють роль природної очисної споруди. Для очищення стоків застосовують декілька типів споруд:  локальні (цехові);  загальні (заводські);  районні (міські). Локальні очисні споруди призначені для очищення стоків безпосере- дньо після технологічних процесів. На локальних очисних спорудах очи- щають воду перед направленням її в систему оборотного водопостачан- ня або в загальнорайонні очисні споруди. На таких установках зазвичай застосовують фізико-хімічні методи очищення (відстоювання, ректифі- кацію, екстракцію, адсорбцію, іонний обмін). 115 Загальні очисні споруди включають декілька ступенів очищення: пе- рвинну (механічну), вторинну (біологічну), третинну (доочищення). Районні або загальноміські споруди очищають в основному побутові стоки методами механічної та біологічної очистки. Біологічний метод очищення заснований на здатності мікроорганіз- мів використовувати в якості ростового субстрату різні сполуки, що вхо- дять до складу стічних вод. Переваги цього методу полягають у можли- вості видалення зі стоків широкого спектру органічних і неорганічних речовин, простоті апаратного оформлення та протікання процесу, відно- сно невисоких експлуатаційних витратах. Для біологічного очищення стічних вод застосовують два типи про- цесів:  анаеробні, при яких мікроорганізми не мають доступу до вільного ро- зчиненого кисню. У цих процесах в якості акцептора електронів мік- роорганізми можуть використовувати вуглець органічних речовин;  аеробні, в яких мікроорганізми використовують для окислення речо- вин кисень. При виборі між аеробними та анаеробними процесами перевагу за- звичай віддають першим. Аеробні системи більш надійні, стабільно фун- кціонують та більше вивчені. 2. АНАЕРОБНІ ПРОЦЕСИ ОЧИЩЕННЯ СТОКІВ Анаеробні процеси очищення стічних вод не отримали достатньо широкого розвитку в даний час. Однак вони, в порівнянні з аеробними процесами очищення стічних вод, мають ряд переваг. Головними вважа- ють високий рівень перетворення вуглецю забруднюючих речовин при відносно невеликих обсягах приросту біомаси і одержання додаткового цінного продукту – біогазу. Анаеробні процеси для очищення стоків застосовуються в Європі близько 100 років. Використовувані для цих цілей біореактори- септиктенки, являють собою відстійники, в яких осівший мул піддається анаеробній деградації. Час перебування в них стоків, що очищаються іс- 116 тотно вищий – менше доби. При проектуванні біореакторів такого типу одним з основних параметрів є його місткість в літрах (V), що розрахову- ється з урахуванням кількості населення, що обслуговується P: V = 180 P + 2000. Мул септиктенків періодично (приблизно раз на рік) видаляється, а невелика його частина залишається в біореакторі. Септиктенки застосовують у системі міських очисних споруд. У них переробляють стоки, що видаляються з первинних відстійників. При зброджуванні обсяг мулу зменшується, знижується вміст в ньо- му патогенних мікроорганізмів і зникає неприємний запах. Шляхи біоде- градації забруднюючих речовин, що протікають в септиктенках на основі складної мікробної асоціації, включають гідролітичні процеси за участю ацидогенних, гетероацетогенних бактерій і процес метаногенераціїї за участю метаногенів. В цілому анаеробні процеси очищення стоків, володіючи рядом без- перечних переваг, не знаходять поки такого широкого застосування, як аеробні системи біоочищення. Однак в останні роки, внаслідок більш су- ворих вимог до попереднього очищення промислових стоків перед ски- данням їх у каналізацію, інтерес до анаеробних процесів зростає. 3. АЕРОБНІ ПРОЦЕСИ ОЧИЩЕННЯ СТОКІВ В аеробних процесах очищення частина окислюваних мікроорганіз- мами органічних речовин використовується в процесах біосинтезу, ін- ша – перетворюється в нешкідливі продукти – Н2О, СО2, NO2 та ін. Принцип дії аеробних систем біоочищення базується на методах проточного культивування. Процес видалення органічних домішок складається з декількох стадій: 1) передачі органічних речовин і кисню з рідини до клітинної поверхні; 2) дифузії речовин і кисню всередину клітин через мембрану; 3) метаболізму, в ході якого відбувається приріст мікробної біомаси з виділенням енергії і вуглекислоти. 117 Інтенсивність і глибина біологічного очищення визначається швид- кістю розмноження мікроорганізмів. Коли в стічних водах, що очища- ються практично не залишається органічних речовин, настає другий етап очищення – нітрифікація. У ході цього процесу азотовмісні речови- ни стоків окислюються до нітритів і далі – до нітратів. Таким чином, аеробне біологічне очищення складається з двох ета- пів: мінералізації – окислення вуглецевмісної органіки, і нітрифікації. Поява в стоках, що очищуються нітратів і нітритів свідчить про глибоку ступінь очищення. Більшість біогенних елементів, необхідних для розви- тку мікроорганізмів (вуглець, кисень, сірка, мікроелементи), міститься в стічних водах. При дефіциті окремих елементів (азоту, калію, фосфору) їх у вигляді солей додають в стоки, що очищаються. У процесах біологічного очищення бере участь складна біологічна асоціація, що складається не тільки з бактерій, але також включає одно- клітинні організми – водні гриби, найпростіші організми (амеби, джгу- тикові та війчасті інфузорії), мікроскопічні тварини (коловертки, круглі черви – нематоди, водні кліщі) та ін. Ця біологічна асоціація в процесі бі- ологічного очищення формується у вигляді активного мулу або біоплів- ки. Активний мул являє собою буро-жовті пластівці розміром 3-150 мкм, зважені у воді, і утворений колоніями мікроорганізмів, у тому числі бак- теріями. Останні формують слизові капсули – зооглей. Біоплівка – це слизувате обростання матеріалу фільтруючого шару очисних споруд жи- вими мікроорганізмами, товщиною 1-3 мм. Біологічне очищення стоків проводиться в різних за конструкцією спорудах – біофільтрах і аеротенках. Крапельний біофільтр – найбільш поширений тип біореактора з нерухомою біоплівкою, що застосовується для очищення стоків. По суті, це реактор з нерухомим шаром і протитечією повітря і рідини. Біомаса росте на поверхні насадки у вигляді плівки. Особливістю насадки або фі- льтруючого шару є висока питома поверхня для розвитку мікроорганіз- мів і велика пористість. Останнє сприяє проходженню повітря і рідини через нього. Біофільтри являють собою прямокутні або круглі споруди з суціль- ними стінками і подвійним дном. Дренажне дно біофільтра складається 118 із залізобетонних плит з площею отворів не менше 5-7% від загальної площі поверхні фільтра. Фільтруючим матеріалом зазвичай служить щебінь, галька гірських порід, керамзит, шлак. Нижній підтримуючий шар у всіх типах біофільт- рів повинен містити більші частки фільтруючого матеріалу (розміром 60-100 мм). Вхідний потік попередньо відстояних стічних вод за допомогою во- дорозподільного пристрою періодично рівномірно зрошує поверхню бі- офільтра. В ході просочування стічних вод через матеріал фільтруючого шару відбувається ряд послідовних процесів: 1) контакт з біоплівкою, що розвивається на поверхні частинок фільт- руючого матеріалу; 2) сорбція органічних речовин поверхнею мікробних клітин; 3) окислення речовин стоків в процесах мікробного метаболізму. Через нижню частину біофільтра протитечією рідини продувається повітря. Під час паузи між циклами зрошення сорбуюча здатність біоплі- вки відновлюється. У біофільтрі відбувається безперервний приріст і відмирання біоп- лівки. Відмерла біоплівка змивається струмом води, що очищається і ви- носиться з біофільтра. Очищена вода надходить у відстійник, в якому звільняється від часток біоплівки, і далі скидається у водойму. Процес окислення органічних речовин супроводжується виділенням тепла, тому біофільтри обігріваються за рахунок власного тепла. Великі установки, забезпечені шаром теплоізоляційного матеріалу, здатні фун- кціонувати при негативній температурі зовнішнього середовища. Однак температура всередині фільтруючого шару повинна бути не нижче 6 °С. З початку 80-х років на зміну мінеральним матеріалам в біофільтрах прийшли пластмаси, що забезпечують велику пористість і кращі гідро- динамічні властивості шару. Це дозволило будувати високі, біореактори, що не займають багато місця і очищати промислові стоки з високою кон- центрацією забруднюючих речовин. Питома поверхня пластмасових на- садок, що використовуються для швидкого фільтрування, вища, ніж у щебеневих біофільтрів. 119 Щебеневі біофільтри, маючи більш низьку об’ємну щільність, мо- жуть досягати висоти до 8-10 м. Цей тип біореактора при швидкому ре- жимі фільтрації стоків забезпечує ступінь видалення 50-60% БПК. Для більш високого ступеня очищення застосовують каскад біофільтрів. Експлуатація біофільтрів – нескладний процес. Важлива умова для ефективної роботи біофільтрів – ретельна попередня очистка стоків від зважених часток, здатних засмітити розподільний пристрій. Несприят- ливими моментами в експлуатації біофільтрів є ймовірність заливання, розмноження мух на поверхні, неприємний запах, внаслідок надлишко- вого утворення мікробної біомаси. В даний час близько 70% очисних споруд Європи та Америки явля- ють собою краплинні біофільтри. Термін служби таких біореакторів об- числюється десятками років (до 50). Основний недолік конструкції – надлишковий ріст мікробної біомаси. Це призводить до засмічення біо- фільтра і викликає збої в системі очищення. Запропонована нещодавно модифікація являє собою установку з почерговим подвійним фільтру- ванням. Система рециркуляції дозволяє виключити негативні моменти, характерні для біофільтрів. Аеротенк відноситься до гомогенного біореактора. Типова конст- рукція біореактора являє собою залізобетонний герметичний посуд прямокутного перерізу, пов’язаний з відстійником. Аеротенк розділяєть- ся поздовжніми перегородками на кілька коридорів, зазвичай 3-4. Конс- трукційні відмінності ряду аеротенків пов’язані, в основному, з конфігу- рацією біореактора, методом подачі кисню, величиною навантаження. Процес біоочищення в аеротенку складається з двох етапів. Перший етап полягає у взаємодії відстояних стічних вод, що містять близько 150- 200 мг/л зважених часток і до 200-300 мг/л органічних речовин, з повіт- рям і частками активного мулу в аеротенку протягом деякого часу (від 4 до 24 год і вище в залежності від типу стоків, вимог до глибини очищен- ня та ін.). На другому – відбувається розділення води і частинок активно- го мулу у вторинному відстійнику. Біохімічне окислення органічних речовин стоків в аеротенку на першому етапі реалізується у дві стадії: на першій мікроорганізми акти- 120 вного мулу адсорбують забруднюючі речовини стоків, на другій – окис- люють їх і відновлюють свою окислювальну здатність. Подача повітря в «коридори» аеротенку здійснюється через пористі залізобетонні плити або через систему пористих керамічних труб. Зазви- чай повітророзподільний пристрій розташовують не по центру, а близь- ко однієї із стін коридору. У результаті цього в аеротенку відбувається турбулізація потоку, і стічні води не тільки просуваються уздовж кори- дору, але і закручуються по спіралі усередині нього. Це покращує режим аерації і умови очищення. Процес очищення в аеротенках являє собою безперервну фермента- цію. У порівнянні з біоплівкою, що функціонує в біофільтрах, активний мул аеротенків являє собою меншу екологічну різноманітність видів. Основні групи бактеріальної компоненти активного мулу флокулюючі бактерії, ни- тчасті бактерії та бактерії нітрифікатори. Перша група бактерій не тіль- ки бере участь у деградації органічних компонентів стоків, а й формує ста- більні флокули (структури більші пластівців), що швидко осідають у відс- тійнику з утворенням щільного мулу. Нітрифікатори (Nitrosomonas і Nitrobacter) перетворюють відновлені форми азоту в окислені: NH3 + O2 Nitrosomonas → NO2-, NO2-+ O2 Nitrobacter → NO3- Нитчасті бактерії, з одного боку, утворюють скелет, навколо якого утворюються флокули, з іншого, – стимулюють несприятливі процеси (утворення піни і погане осадження). Найпростіші – споживають бактерії і знижують каламутність стоків (найбільше значення серед них мають інфузорії). Мікроорганізми і найпростіші, що входять до складу активного мулу мають набір ферментів для видалення забруднень зі стоків. Концентрація активного мулу в аеротенку, зазвичай, становить 1,5-5,0 г/л. Ця величина залежить від рівня забруднень стоків, від віку мулу і його продуктивності. Досвід експлуатації різних типів аеротенків показує, що вміст орга- нічних речовин у стоках, що подаються на очищення, не повинно пере- вищувати 1000 мг/л. Оптимальна величина рН зазвичай лежить в діапа- зоні 6,5-8,5. 121 Приріст біомаси активного мулу в ході очищення призводить до йо- го «старіння» і зниження біокаталітичної активності. Тому велика части- на активного мулу після вторинного відстійника виводиться з системи, і тільки частина мулу повертається в реактор. Аеротенки технологічно пов’язані з вторинними відстійниками, в яких відбувається освітлення води, що виводиться та відділення активного мулу. Відстійники викону- ють також функцію контактних резервуарів. У них стічну воду хлорують. Дезинфікуюча доза хлору після біологічної очистки в залежності від яко- сті очищення становить 10-15 мг/л при тривалості контакту хлору з рі- диною не менше 30 хвилин. Біологічні (очисні) ставки використовуються в якості самостійної очисної споруди або кінцевого пункту очищення стоків, що пройшли стадію біоочищення в біофільтрах або аеротенках. Якщо очисні стави функціонують як самостійні системи водоочищення, стічні води перед надходженням в них розбавляються трьох-, п’ятикратними обсягами те- хнічної або господарсько-питної води. Методи аеробної біологічної очистки стічних вод безперервно вдос- коналюються. В останні роки стали впроваджуватися більш ефективні системи біоочищення. Це шахтні біореактори та процеси з використан- ням для аерування кисню. Такі біореактори називають окситенками. Концентрація розчиненого кисню в окситенках досягає 10-12 мг/л. Це в кілька разів перевищує рівень аерації в аеротенках. У результаті підви- щеної аерації стоків концентрація активного мулу в них зростає до 15 г/л і їх окислювальна потужність в 4-5 разів перевершує аеротенки. Шахтні біореактори дозволяють реалізувати процес очищення сто- ків аналогічно протіканню його в окислювальному каналі, але розташо- ваному вертикально. Такі реактори займають невеликі площі і здебіль- шого заглиблені в грунт. Висота шахтних апаратів досягає 50-150 м при діаметрі 0,5-10,0 м. 122 4. ЗАСТОСУВАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ ДЛЯ ОЧИЩЕННЯ ГАЗО-ПОВІТРЯНИХ ВИКИДІВ І ДЕГРАДАЦІЇ КСЕНОБІОТИКІВ Проблема боротьби з забрудненням повітряного басейну в умовах зростаючої технологічної діяльності набуває все більшої гостроти. У по- вітрі великих промислових міст міститься величезна кількість шкідли- вих речовин. При цьому концентрація багатьох токсикантів перевищує допустимі рівні. Основний внесок у забруднення атмосфери вносять під- приємства нафтопереробної, хімічної, харчової та переробної промисло- вості, а також великі сільськогосподарські комплекси, відстійники стіч- них вод, установки по знешкодженню відходів. Серед цих речовин – органічні (ароматичні і ненасичені вуглеводні, азото- кисне-, сірко- і галогеновмісні сполуки) та неорганічні речовини (сірчистий газ, сірковуглець, оксиди вуглецю, аміак та ін.). У повітряних басейнах великих промислових міст присутні десятки різних сполук, в тому числі з неприємним запахом, здатні навіть в незначних концентра- ціях становити загрозу для здоров’я, а також викликати у людей почуття дискомфорту. Для очищення повітря застосовують різні методи – фізичні, хімічні і біологічні, проте рівень і масштаби їх застосування в даний час надзви- чайно далекі від необхідних. Серед застосовуваних фізичних методів – абсорбція (вибіркове поглинання речовини з газового чи рідкого середови- ща усім об’ємом твердого тіла чи рідини) домішок на активованому ву- гіллі та інших поглиначів, абсорбція рідинами. Найбільш поширеними хімічними методами очищення повітря є озонування, прожарювання, хлорування. Біологічні методи очищення газоповітряних викидів почали застосовувати порівняно недавно, і поки в обмежених масштабах. Біологічні методи очищення повітря базуються на здатності мікроо- рганізмів руйнувати в аеробних умовах широкий спектр речовин і спо- лук до кінцевих продуктів СО2 і Н2О. Широко відома здатність мікроорга- нізмів метаболізувати аліфатичні, ароматичні, гетероциклічні, ациклічні та різні С1-сполуки. Мікроорганізми утилізують аміак, окислюють сірчи- 123 стий газ, сірководень. Утворені сульфати утилізуються іншими мікроб- ними видами. Є дані про ефективне окислення аеробними карбоксидо- бактеріями моноокису вуглецю (СО), що є одним з найбільш небезпечних повітряних забруднювачів. Представники роду Nocardia ефективно руй- нують стерини і ксилол; Hyphomicrobium – дихлоретан; Xanthobacterium – етан і дихлоретан; Mycobacterium – вінілхлорид. Найбільш широким спектром катаболічних шляхів характеризують- ся грунтові мікроорганізми. Так, тільки представники роду Pseudomonas здатні використовувати в якості єдиного джерела вуглецю, сірки або азоту понад 100 сполук – забруднювачів біосфери. Великі можливості для підвищення біосинтетичного потенціалу мі- крорганізмів-деструкторів токсичних речовин маються на озброєнні у мікробіологів і генетиків, включаючи методи традиційної селекції і від- бору, а також новітні досягнення клітинної та генетичної інженерії. Пе- реважна кількість токсичних забруднювачів атмосфери може бути зруй- нована монокультурами мікроорганізмів, але більш ефективним є засто- сування змішаних культур, що мають більший каталітичний потенціал. Для біологічного очищення повітря застосовують три типи устано- вок: біофільтри, біоскрубери і біореактори з омиваючим шаром. Основним елементом біофільтру для очищення повітря, як і водоо- чисного біофільтру, є фільтруючий шар, який сорбує токсичні речовини з повітря. Далі ці речовини в розчиненому вигляді дифундують до мікроб- них клітин, включаються в них і піддаються деструкції. В якості носія для фільтруючого шару використовують природні ма- теріали – компост, торф та ін. Ці матеріали містять у своєму складі різні мінеральні солі і речовини, необхідні для розвитку мікроорганізмів. Тому в біофільтри не вносять жодних мінеральних добавок. Повітря, що підля- гає очищенню, подається вентилятором в систему, проходить через фі- льтруючий шар в будь-якому напрямку, знизу вгору або навпаки. При цьому повітря повинне проходити через всю масу фільтруючого шару рі- вномірно. Тому потрібна однорідність шару і певна ступінь вологості. У матеріалі не повинно виникати температурних градієнтів, а також не по- винно відбуватися різких змін рН середовища. Тому температурний ре- жим в біофільтрі підтримується постійним. Для цього повітря, що пода- ється в біофільтр, підігрівається, установка в цілому термостатується. 124 Для забезпечення стабільної роботи біофільтрів слід дотримуватися комплексу заходів, найважливішими з яких є наступні. Повітря, що пода- ється на очистку в біофільтр, попередньо зволожують в біоскрубері до відносної вологості в 95-100%. При заповненні фільтруючого шару для зниження аеродинамічного опору в матеріал додають гранули (діамет- ром 3-10 мм) з синтетичних полімерних матеріалів (поліетилену, поліс- тиролу), а також частинки автопокришок, активоване вугілля. Маса до- бавок становить від 30 до 70% від маси фільтруючого матеріалу. Для запобігання різкого закислення матеріалу фільтруючого шару в ході трансформації органіки в нього додають вапняк або карбонат каль- цію в кількості 2-40% від ваги носія. З метою уникнення ситуацій, коли мікроорганізми, що входять до складу робочого тіла біофільтра, можуть інгібуватися токсичними речовинами в результаті, наприклад, залпових викидів, в матеріал вносять активоване вугілля, до 250 кг/м3. Ефективність роботи біофільтра визначається газодинамічними па- раметрами фільтруючого шару, спектром і концентрацією присутніх в по- вітрі речовин і ферментативною активністю мікрорганізмів-деструкторів. При цьому швидкість видалення шкідливих домішок з повітря в процесі бі- оочищення може лімітуватися як дифузією речовин з газової фази в біока- талітичний шар, так і швидкістю протікання біохімічних реакцій в мікроб- них клітинах. При високій вхідній концентрації шкідливих речовин у пові- трі процес їх деструкції в ході проходження потоку через фільтруючий шар нерівномірний. Спочатку руйнуються легкодоступні речовини, і тільки в кінці процесу починається руйнування важкодеградуючих сполук. Так, при наявності у повітрі в якості шкідливих домішок комплексу сполук бутано- лу, етилацетату, бутилацетату і толуолу останній утилізується мікроорга- нізмами тільки після окислення всіх інших речовин. Стаціонарний стан і найбільш висока швидкість біоочищення насту- пають через деякий час після запуску біофільтра. Потрібно певний пері- од для дозрівання і адаптації мікробіологічного ценозу. Тривалість періоду адаптації залежить від концентрації речовин в повітрі і мікробного складу в дифузійному шарі і може становити від де- кількох годин до декількох тижнів. 125 Принцип функціонування біоскруберів відрізняється тим, що процес очищення повітря реалізується у дві стадії у двох різних установках. На першому етапі в абсорбері токсичні речовини, що знаходяться в повітрі, а також кисень розчиняються у воді. У результаті повітря виходить очище- ним, а забруднена вода далі йде на очистку в аеротенк. Очищення води в аеротенку відбувається за звичайною схемою з участю кисню. В ході очи- щення складні органічні речовини окислюються мікроорганізмами, що фо- рмують активний мул, до кінцевих продуктів з утворенням біомаси. Біореактор з омиваючим шаром. Робочим тілом цієї біосистеми є іммо- білізовані мікроорганізми. Біошар реактора являє собою гранули з іммобі- лізованими мікробними клітинами. Цей шар омивається водою, що містить необхідні для розвитку клітин мінеральні речовини. Забруднене повітря проходить через нього, при цьому речовини, що підлягають деструкції, ди- фундують у водну плівку, що вкриває частинки біокаталізатора, і далі оки- снюються мікроорганізмами. Швидкість деструкції може лімітувати швид- кістю дифузії речовин з газової фази в рідку, а також швидкістю протікан- ня реакцій у мікробних клітинах. Швидкість дифузії, в свою чергу, залежить від природи токсичних речовин і їх концентрацій. Стаціонарний режим бі- ореактора з омиваним шаром після його запуску настає через 5-10 днів. При використанні заздалегідь адаптованих до очищувальних речовин мік- роорганізмів цей термін може бути скорочений до декількох годин. Періо- дично, зазвичай раз на кілька місяців, біошар очищають від надлишку біо- маси і наповнюють свіжими гранулами. Основні вимоги, запропоновані до установок біологічної очистки га- зів, полягають у простоті і експлуатаційній надійності конструкції, висо- кій питомій продуктивності та високому ступені очищення. Масштаби промислового застосування методів біологічного очи- щення повітря в даний час досить незначні. Найбільш поширеним типом установок є біофільтри. Вони досить дешеві, малоенергоємкі, вимагають незначних витрат води. Однак продуктивність біофільтрів порівняно не- висока – від 5 до 400 м3 очищуваного повітря на 1 м2 поперечного перері- зу фільтруючого шару/год. Головним чином, це визначається низьким вмістом мікроорганізмів в одиниці об’єму матеріалу фільтруючого шару. Висота біофільтрів через вимоги однорідності структури і газодинаміч- 126 них обмежень невелика (близько 1 м), тому вони займають великі площі (від 10 до 1600 м2). Біоскрубери в порівнянні з біофільтрами займають меншу площу, тому що являють собою вежі висотою в кілька метрів. Експлуатаційні витрати при використанні біоскруберів вищі, так як процес біоочищення води вимагає істотних витрат. Застосування біоскруберів ефективно за наявності у повітрі добре розчинних токсичних речовин. Продуктивність біоскруберів істотно вища в порівнянні з біофільтрами, при цьому ефек- тивність очищення також висока. Наприклад, застосування біоскруберів для очищення відхідних газів металургійних підприємств дає наступні показники: продуктивність 120 000 м3/год, зниження інтесивності запа- ху повітря – від 75 до 85%, ступінь конверсії органічних домішок – 50%. Найбільш перспективними для очищення повітря є біореактори з омиваючим шаром. Ці установки, практично не поступаючись в ступені очищення, характеризуються більш високою питомою продуктивністю (кілька тисяч кубометрів очищуваного повітря за годину). Такі малога- баритні установки дуже ефективні для очищення повітря підприємств інтенсивного тваринництва. Ступінь очищення повітря в реакторі з іммобілізованими на активованому вугіллі мікроорганізмами від ацето- ну, бутанолу, пропіонового альдегіду, етилацетату сягає 90%. Описано інші підходи для очищення повітря, наприклад, на основі зростаючої суспензії мікроорганізмів. Пропускання повітря, насиченого сірководнем, сірчистим ангідридом і парами сірчаної кислоти, через ін- тенсивну культуру мікроводорості Chlorella, що має велику поверхню ко- нтакту суспензії з повітрям, забезпечує 100%-не очищення повітря при продуктивності установки до 1 млн м3/год. Відомі способи комплексного очищення стоків та забрудненого повітря від аліфатичних кислот, спир- тів, альдегідів і вуглеводнів в аеротенку з активним мулом. Показана можливість ефективного очищення повітря ряду фарма- цевтичних виробництв на основі іммобілізованих мікробних клітин. Утворені в багатьох виробничих процесах відновлені сполуки сірки (тіосульфат, сірководень, диметилсульфід) можуть служити джерелом енергії для багатьох мікроорганізмів. Один з методів очищення від сір- ководню полягає в пропущенні повітря через сольовий розчин міді. 127 Утворюваний в результаті цього нерозчинний сульфід металу далі може бути окислений за участю мікроорганізмів. Можливе створення системи біоочищення повітря від сірководню, а також органічних сполук сірки з використанням тіобацил. Таким чином, в даний час в промислових масштабах застосовуються досить ефективні біологічні процеси для очищення газоповітряних ви- кидів. Існують реальні наукові основи для розробки та впровадження нових методів біоочищення. Біодеградація ксенобіотиків. Ксенобіотики – чужорідні для організ- мів сполуки (пестициди, ПАР, барвники, лікарські речовини та ін.), які практично не включаються до циклів вуглецю, азоту, сірки або фосфору. Ксенобіотики тимчасово або постійно накопичуються в навколишньому середовищі і шкідливо впливають на все живе. Накопичення ксенобіотиків становить величезну небезпеку для лю- дини, що вживає в їжу велику рибу і вищих тварин. Деградація ксенобіотиків може відбуватися в результаті фізичних і хімічних процесів і суттєво залежить від типу грунту, його структури, вологості, температури та ін. Біологічна трансформація сполук, що пот- рапили в навколишнє середовище, може протікати в різних напрямках, призводячи до мінералізації, накопичення або полімеризації. Ксенобіо- тики, які піддаються повній деградації, тобто мінералізуються до діокси- ду вуглецю, води, аміаку, сульфатів і фосфатів, використовуються мікро- організмами в якості основних ростових субстратів і проходять повний метаболічний цикл. Часткова трансформація сполук відбувається, як правило, в процесах кометаболізму або співокислення і не пов’язана з включенням утворюваних продуктів в метаболічний цикл мікроорганіз- мів. Нарешті, деякі ароматичні вуглеводні і синтетичні полімери взагалі не піддаються біологічній трансформації. Поведінка ксенобіотика в природі залежить від багатьох взаємо- пов’язаних факторів: структури і властивостей самої речовини, фізико- хімічних умов середовища і її біокаталітичного потенціалу, зумовленого мікробним складом. Всі ці фактори в сукупності визначають швидкість і глибину трансформації ксенобіотика. Не можна забувати про те, що біо- логічна деградація ксенобіотиків виправдана тільки тоді, коли відбува- 128 ється їх повна мінералізація, руйнування і детоксикація. Це може бути досягнуто в результаті всього однієї модифікації структури сполуки. Од- нак часто в ході деградації відбувається серія послідовних модифікацій вихідної сполуки за участю декількох мікробних видів. Важливу роль у видаленні ксенобіотиків з навколишнього середовища відіграють різно- манітні типи мікробного метаболізму. У природних умовах на ксенобіо- тики впливають мікробні спільноти. Саме завдяки гетерогенності при- родних мікробних спільнот ксенобіотики в принципі можуть піддаватися біодеградації, а наявність в мікробних співтовариствах взаємопов’язаних метаболічних шляхів руйнування токсинів є основою для боротьби із за- брудненням навколишнього середовища. Є два шляхи для боротьби із забрудненням біосфери ксенобіотика- ми: збір та детоксикація ксенобіотиків до моменту потрапляння в навко- лишнє середовище і трансформація або видалення ксенобіотиків, які по- трапили в середовище. Можливості мікробних спільнот у відношенні деградації багатьох токсичних сполук значні. Доведено, що при повторному попаданні в се- редовище багатьох хімічних сполук час до початку їх трансформації (так званий адаптаційний період мікроорганізмів по відношенню до даного субстрату) значно коротший у порівнянні з першим попаданням цього з’єднання. Протягом цього періоду мікроорганізми в ході адаптації до токсичної сполуки як субстрату відбираються по здатності деградувати даний субстрат. В результаті природним шляхом виникають мікробні популяції, які, як виявилося, можуть зберігатися в грунті протягом декі- лькох місяців після повної деградації токсиканту. Тому до моменту ново- го надходження цієї сполуки в грунт в ній уже присутні адаптовані мік- роорганізми, здатні атакувати токсикант. Таким чином, після потрапляння ксенобіотиків в навколишнє сере- довище з грунту можна виділити мікробні види, здатні деградувати кон- кретні ксенобіотики і далі серед них вести селекцію на збільшення шви- дкості деградації. При попаданні нових речовин у навколишнє середовище може від- буватися природне генетичне конструювання, в результаті якого вини- кають мікробні форми з новими катаболічними функціями. Величезна 129 роль у процесах міжорганізмового перенесення генетичної інформації, що призводять до біохімічної мінливості популяцій, належить плазмі- дам – позахромосомних генетичним елементам. Катаболічні, або дегра- дативні плазміди кодують реакції мінералізації або трасформації ксено- біотиків, надають мікроорганізмам здатність перерозподіляти між собою пул деградативних генів. В даний час описані різноманітні природні ка- таболічні плазміди, що зустрічаються в різних представників грунтової мікрофлори. Особливо часто вони ідентифікуються серед роду Pseudomonas. Інформація, яку несуть плазміди, може розширити коло субстратів господаря за рахунок об’єднання двох метаболічних шляхів, або повним кодуванням нового шляху, або доповненням існуючих мета- болічних шляхів. Відомі також випадки перерозподілу генетичного матеріалу між плазмідами і хромосомою господаря, що призводять до появи зовсім но- вих генів. Пластичність катаболічних плазмід забезпечує перерозподіл генетичного матеріалу, що може призвести до виникнення в природі но- вого організму, ефективно деградуючого новий субстрат. Таким чином, природні генетичні механізми обміну інформацією до- зволяють отримувати ефективні штами-деструктори ксенобіотиків. Це тим більш важливо, так як загальноприйняті методи роботи з рекомбі- нантними ДНК, що застосовуються для клонування чужорідної ДНК з не- великим числом генів, мають суттєві обмеження при клонуванні метабо- лічних шляхів деградації ксенобіотиків, кодованих десятками генів. Об- меження також обумовлені недоліком знань про механізми деградації та структурі метаболічних шляхів, а також можливостями ризику, пов’язаного з потраплянням сконструйованих організмів в середовище. Методи генетичної інженерії можуть бути корисними для вдосконален- ня вже існуючих деградативних здібностей мікробних клітин. Біологічні методи також застосовуються для очищення природного середовища від нафтових забруднень, що представляють собою як стічні води нафтової промисловості, так і безпосереднє забруднення в резуль- таті розливу нафти. Стічні води нафтової промисловості очищають біо- логічними методами після видалення більшої частини суміші різних вуг- леводнів фізичними методами. Для цього застосовують аеруючі системи 130 біоочищення з активним мулом, що містить адаптоване до компонентів нафти співтовариство. Швидкість деградації залежить від якісного скла- ду і концентрації вуглеводнів, а також температури і ступеня аерації се- редовища. Найбільш ефективно біодеградація здійснюється, коли нафта емульгована у воді. Особливу проблему становлять викиди і аварійні розливи нафти на поверхню грунту. Це призводить до забруднення не тільки орних земель, але також і джерел питної води. У грунті міститься багато мікробних ви- дів, здатних деградувати вуглеводні, але їх активність часто низька, в тому числі і в результаті дефіциту окремих біогенних елементів. У таких випадках ефективним є внесення в грунт так званих олеофільних доб- рив, до складу яких входять сполуки азоту, фосфати та інші мінеральні елементи, концентрації яких в грунті досить низькі і лімітують ріст мік- роорганізмів. Після внесення цих сполук у грунт концентрація мікроор- ганізмів-деструкторів істотно зростає, і зростає швидкість деградації на- фти. За допомогою генетичного конструювання створений «супермі- кроб», здатний утилізувати більшість основних вуглеводнів нафти. Використання методів генетичного конструювання мікробних шта- мів-деструкторів ксенобіотиків для практичного застосування перебуває на ранній стадії. Одна з основних проблем при конструюванні мікрооргані- змів на основі природних катаболічних плазмід – стабільність. Стабільність систем «господар-вектор» особливо важлива при інтродукції штамів в при- родне середовище. При поверненні мікроорганізму з новою катаболічною функцією у вихідне природне середовище йому доводиться конкурувати з добре адаптованою до даних умов середовища природною мікрофлорою, стикатися з величезною різноманітністю джерел вуглецю, у тому числі ви- сокотоксичних. При цьому абсолютно неясні перспективи збереження ста- більності нової катаболічної функції і, отже, самого штаму. Поки існує великий розрив між досягненнями, отриманими в конст- руюванні мікроорганізмів, і можливостями їх практичного застосування. Ймовірно, в майбутньому найбільш перспективними для детоксикації ксенобіотиків будуть біологічні системи, що складаються з мікробіологі- чної консорції індивідуальних організмів і мікробних спільнот, отрима- них методами клітинної та генетичної інженерії. 131 КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Опишіть яким чином біотехнологія вирішує очищення стічних вод? 2. Які єтипи біологічних способів очищення стоків? 3. Опишіть анаеробні процеси очищення стоків. 4. Охарактеризуйте аеробні процеси очищення стоків. 5. Опишіть крапельний біофільтр та аеротенк. 6. Які установки використовують для біологічного очщення повітря? 7. Які є шляхи для боротьби із забрудненням біосфери ксенобіотиками? 132 НАНОТЕХНОЛОГІЇ ТА НАНОБІОТЕХНОЛОГІЯ ПЛАН 1. Нанотехнологія, основні напрями і завдання нанотехнологій. 2. Нанобіологія та нанобіотехнологія. 3. Основні напрямки розвитку нанобіотехнологій. 4. Розвиток нанобіотехнологій в Україні. 1. НАНОТЕХНОЛОГІЯ, ОСНОВНІ НАПРЯМИ І ЗАВДАННЯ НАНОТЕХНОЛОГІЙ Під нанотехнологіями розуміють фундаментальні технології, засно- вані на маніпуляціях з наноструктурами (наночастинками). Наноструктури – це об’єкти, розміри яких лежать в діапазоні від 1 до 100 нанометрів (1 нанометр дорівнює 10-9 м). Наномасштаб унікальний, оскільки найбільш фундаментальні влас- тивості матеріалів наносвіту залежать від їх розміру так, як не залежать ні при жодному іншому масштабі. Багато властивостей твердих тіл (тем- пература плавлення, електропровідність, область прозорості, магнетизм та ін.) при зменшенні кристала до розмірів 10-20 нм і менше починають залежати від розміру. Таким чином, з’являється можливість створювати нові матеріали не шляхом зміни хімічного складу компонентів, а в ре- зультаті регулювання розмірів і форми частинок їх складових. На молекулярному рівні проявляються нові властивості, які визна- чаються поведінкою молекулярних нанокомплексів. Можливість розумі- ти, розробляти і контролювати ці властивості відкриває цілий світ фун- кціональних молекулярних механізмів і технологій. Наноструктури не просто найменше, що створювала людина, вони є найменшими твердими матеріалами, які можна зробити (виділити) і з якими можна здійснити маніпуляції. 133 Багато джерел, в першу чергу англомовні, першу згадку методів, які згодом будуть названі нанотехнологією, пов’язують з відомим виступом Річарда Фейнмана «Там внизу багато місця», зробленим ним в 1959 році в Каліфорнійському технологічному інституті на щорічній зустрічі Аме- риканського фізичного товариства. Річард Фейнман припустив, що мож- ливо механічно переміщати поодинокі атоми, за допомогою маніпулято- ра відповідного розміру. Фейнман висловив припущення, що в майбут- ньому багато матеріалів та пристроїв будуть виготовлятися на атомар- ному або молекулярному рівні і це допоможе отримувати матеріали з небаченими досі властивостями. Термін «нанотехнологія» був вперше запропонований в 1974 р. професором Університету Токіо Норіо Танігучі для позначення процесів керування властивостями матеріалів на нанометровому масштабі. У 1980-х роках цей термін використав Ерік К. Дрекслер в своїх книгах: «Машини створення: гряде ера нанотехнології». Центральне місце в його дослідженнях грали математичні розрахунки, за допомогою яких можна було проаналізувати роботу пристрою розмірами в декілька нанометрів. Сьогодні на основі нанотехнологій розроблені консолідовані нано- матеріали, нанонапівпровідники, нанополімери, нанобіоматеріали, фу- лерени, нанотрубки, наночастинки, нанопорошки, нанопористі матеріа- ли, наноструктурні рідини (колоїди, міцели, гелі), фармакологічні нано- препарати. У світлі сучасних технологій починають інтенсивно викорис- товуватися наноматеріали (НМ) – дисперсні матеріали, що містять стру- ктурні елементи, геометричні розміри яких не перевищують 100 нм. Міжнародна організація зі стандартизації ISO (International Organization for Standardization) створила «Технічний комітет 229 – нанотехнології» (ISO/ТС 229), метою якого є розробка міжнародних стандартів нанотех- нології, номенклатури, метрології, специфікації, методології тестування, підготовка інструкцій для галузей охорони здоров’я та безпеки довкілля за використання наноматеріалів. Сьогодні, відповідно до вимог ISO, представлена детальна класифікація наночастинок і наноматеріалів за їх розмірами, структурою, хімічним походженням, властивостями. Для прискореного розвитку нанотехнологій та ефективного застосу- вання результатів майже у всіх країнах світу створюють спеціальні лабора- 134 торії, центри, інститути, комітети, у яких проводять дослідження з різних напрямів нанонауки. У США ще в 2000 р. створено науковий центр «Націо- нальна нанотехнологічна ініціатива», де зосереджено основні дослідження з цього наукового напряму. У світі понад 50 країн упроваджують спеціальні програми розвитку нанотехнологій і постійно збільшують обсяги інвести- цій у ці програми. Вони стали важливим фактором науково-технічного про- гресу та інноваційної складової економіки багатьох країн. Підґрунтя ринку світових інвестицій становлять п’ятнадцять країн, серед них – США, Японія, Велика Британія, Німеччина, Ізраїль, Китай, Канада, Австралія та інші. У бі- льшості з них частка державних витрат у сфері нанонауки і нанотехнологій перевищує 50% від загального обсягу фінансування. В Україні також проводяться певні заходи для вирішення цієї важ- ливої проблеми. Так, Кабінетом Міністрів України було затверджено Державну цільову науково-технічну програму «Нанотехнології і нанома- теріали». Головною метою її було визнання стратегічної пріоритетності розробок нанатехнологій і наноматеріалів, їхнє використання на держа- вному рівні, подолання відставання країни в здійсненні наукового і ме- тодичного забезпечення координації досліджень, формування і розвиток технологічної бази. У сфері фундаментальних наукових досліджень українські науковці займають вагомі позиції, водночас у сфері практичного впровадження нанотехнологій й розвитку наноіндустріальних виробництв наша країна відстає від лідерів на десятки років. Основна сфера використання нанотехнологій – теоретично обґрун- товані експериментальні дослідження в галузі синтезу, аналізу, вироб- ництва й застосування продуктів з визначеною структурою за допомо- гою спрямованого маніпулювання на рівні атомних і молекулярних вза- ємодій. Нанотехнології перебувають на передньому краю різноманітних наукових, економічних та соціальних напрямів розвитку науково- технічного прогресу. Їх застосовують у медицині, електроніці й екології. Інноваційні розробки на рівні атомів і молекул – дійсно великий крок у майбутнє науки, зокрема медицини, біології, ветеринарії. 135 2. НАНОБІОЛОГІЯ ТА НАНОБІОТЕХНОЛОГІЯ Розвиток нанотехнології дав початок новим галузям наук, однією з яких є нанобіологія, яка присвячена вивченню структурних змін, біологі- чних і біофізичних процесів у природних біологічних об’єктах чи їх нано- біологічних аналогах. Пізнання законів, яким підпорядковані біологічні системи, створення на цій основі дієвих наномоделей біологічних струк- тур, сьогодні формують основу нанобіології. Досягнення нанобіології дають основу розвитку таких напрямів нанонауки, як біоорганічна нано- хімія, нанофармація, наносенсорика тощо. Біологи побачили в нанотех- нології можливий якісний прорив у розвитку науки, що дозволяє працю- вати з речовиною в нанометрових масштабах, оскільки ці розміри харак- терні для основних біологічних структур – клітин і молекул. Використання останніх досягнень нанотехнологій в біології призве- ло до появи нового напряму – нанобіотехнології. Нанобіотехнології – розділ в нанотехнологіях, присвячений ви- вченню впливу наночастинок на живі системи, а також розробці способів моделювання та практичного застосування біологічних наноструктур, наноявищ і нанопроцесів в експериментальній біології, медицині, еколо- гії, сільському господарстві та інших галузях економіки. До біологічних наноструктур можна віднести, наприклад, молекули білків, розміри яких варіюють в межах від 4 до 50 нм. Розміри будівель- них блоків білків – амінокислот – складають близько 1 нм. Молекула ДНК, що має діаметр 1-2 нм, безсумнівно, є наноструктурою, незважаючи на те, що її довжина досягає декількох міліметрів. З живих організмів до наносвіту можна віднести тільки неклітинні форми життя – віруси. Розміри останніх коливаються в межах 10-200 нм. У технологіях створення наночастинок існує два принципово різних підходи до обробки речовини:  «зверху вниз», тобто зменшення розмірів фізичних тіл механічною або іншою обробкою до об’єктів з нанометровими розмірами;  «знизу вверх», тобто збірка створюваного більшого нанооб’єкту з елементів «нижчого порядку» (атомів, молекул, структурних фрагме- нтів біологічних клітин і т.п.). 136 Процеси, в які втягуються наноструктури (наночастинки) отримали назву нанопроцесів. Найголовнішим нанопроцесом в живому організмі є біосинтез білка. Явища живої природи, що протікають за участю наноструктур на- звані наноявищами. Дивно, але самоочищення листя лотоса, який на Сході вважається символом чистоти, можна віднести до наноявищ. Листя лотоса покриті мікрогорбиками висотою 5-10 мкм, від яких відростають нановолоски. Завдяки останнім, краплі дощу не розтікаються, а скочу- ються по поверхні листка, захоплюючи за собою частки бруду і очищаю- чи листя лотоса. Набагато більш давнім наноявищем можна розглядати самовідтво- рення (аутореплікацію) ДНК. Це надзвичайно складне явище характери- зувало вже перших прокаріотів Землі – бактерій, що виникли близько 3,5 млрд років тому. 3. ОСНОВНІ НАПРЯМКИ РОЗВИТКУ НАНОБІОТЕХНОЛОГІЙ Основні напрямки розвитку нанобіотехнологій можна об’єднати в три групи:  моделювання і відтворення наноявищ і наномеханізмів живих систем в лабораторних і виробничих умовах;  отримання наночастинок і наноматеріалів за участю живих організмів;  використання наноструктур і нанопроцесів для вторгнення в живий організм з метою його дослідження, діагностики стану і лікування. Конкретними завданнями нанобіотехнологій в даний час вва- жаються:  рішення фундаментальних біологічних проблем, невирішених за до- помогою традиційних цитологічних і цитохімічних методик (моде- лювання біологічних процесів, аналіз поведінки біомолекул і атомно- молекулярних комплексів живих клітин, моніторинг життєдіяльності окремих клітин); 137  вивчення взаємодії наночастинок з молекулами ДНК з метою розроб- ки нових методів генетичної інженерії;  вивчення механізмів транспорту речовин через біологічні мембрани із застосуванням наночастинок і створення нанотехнологій спрямо- ваної доставки ліків;  розробка біосенсорних систем для біології та медицини з метою ви- явлення певної речовини в навколишньому середовищі або організмі людини, а також для виявлення мутацій;  вивчення можливостей застосування наночастинок в якості нових на- номатеріалів медичного призначення: сорбенти для виведення з орга- нізму або видалення з його поверхні небажаних і токсичних сполук (продукти метаболізму, важкі метали, радіонукліди, ксенобіотики);  створення нових високочутливих і зручних в застосуванні систем для діагностики та ефективного лікування захворювань на самих ранніх стадіях розвитку;  розробка та створення на основі нанобіочастинок нанотехнологій і наноматеріалів для виділення білків, їх модифікації та подальшого виробництва білкових препаратів;  розробка самовідтворюваних систем на основі біоаналогів – бактерій, вірусів, найпростіших тварин;  вивчення впливу наночастинок на складноорганізовані біологічні си- стеми, включаючи організми тварин і людини;  розробка на основі нанобіотехнологій лікувальних препаратів нового покоління;  створення біологічно сумісних (невідторгнутих організмом) медич- них матеріалів для пересадки в живий організм;  розробка нанороботів, здатних усувати виникаючі в органах вогнища ураження, і не провокують імунні реакції. 138 4. РОЗВИТОК НАНОТЕХНОЛОГІЙ В УКРАЇНІ У Національній академії наук (НАН) України сформовано комплекс- ну програму фундаментальних досліджень «Наноструктурні системи, наноматеріали, нанотехнології», у межах якої здійснюють дослідження з фізики металів і сплавів, хімії поверхні, порошкових технологій, мікрое- лектроніки, колоїдних нанорозчинів, сорбентів, лікарських засобів, в ос- нову яких покладено нанотехнології. Сьогодні в багатьох науково-дослідних установах не тільки синтезу- ють наночастинки, а й проводять дослідження з визначення механізмів їх- ньої дії, біологічних ефектів, зокрема стимулювання фізіолого-біохімічних процесів у клітинах організму, а також біобезпечності та токсичності. Так, в «Інституті монокристалів» НАН України розроблено нанома- теріали, які можна застосовувати в медичній практиці та фармації. Ін- ститут хімії поверхні імені О.О. Чуйка НАН України спільно з вітчизняни- ми науково-медичними закладами вперше у світі розробив, дослідив та впровадив у медичну практику новий препарат сорбційнодезінтоксика- ційної дії на основі нанокремнезему «Силікс». На кафедрі фармакології та клінічної фармації Національного медичного університету імені О.О. Бо- гомольця розроблено нову лікарську форму – суспензію на основі нано- дисперсного кремнезему. Вона мінімізує токсичність і негативний вплив на функцію печінки таких сполук, як фторид і нітрит натрію, а також протитуберкульозних препаратів – ізоніазиду, піразинаміду, етамбутолу, що різняться механізмом негативного впливу на організм і хімічною структурою. За фармакологічною активністю суспензія нанодисперсного кремнезему перевищує препарати звичайного кремнезему. Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького спільно з Інститутом електрозварювання імені Є.О. Патона розробляє нові варіанти колоїдних систем з магнітними наночастинками Fe3O4 з метою створення протипухлинних препаратів. У співпраці Інституту електрозварювання імені Є.О. Патона та Національного медичного універ- ситету імені О.О. Богомольця встановлено, що наночастинки Аргентуму та Купруму проявляють більш виражену протимікробну дію стосовно Staphylococcus aureus, ніж звичайні препарати цих металів. 139 Наночастинки починають застосовувати у галузі біофізики, молекуля- рної біології, протеоміки, генетики, зокрема для створення біомаркерів. Магнітні наночастинки, на які нанесено антитіла та фрагменти ДНК, мають властивість посилювати сигнал із численних маленьких біомолекул. Це до- зволить діагностувати хворобу на ранніх стадіях й ефективніше лікувати різні захворювання. Водночас синтез наночастинок, які мають властивості ад’ювантів, та їх з’єднання з антигеном (вірусом, бактерією чи їх фрагмен- тами) дає можливість створювати вакцини нового покоління. Так, в галузі ветеринарної медицини безліч наночастинок використовують з метою ви- явлення вірусних, паразитарних та бактеріальних патогенів. Проведені в Iнститут біології тварин (ІБТ) НААН дослідження пока- зали ефективність використання нових полімерних носіїв на основі ди- метиламіноетилметакрилату (поліДМАЕМ) для транспортування анти- сенс-олігодезоксинуклеотидів (асОДН) у клітини ссавців. Встановлено, що поліДМАЕМ у концентрації менш, ніж 5 мкг/мл не чинить цитотокси- чного впливу на культуру клітин ембріональних фібробластів лінії L1210 мишей. Результати дослідження впливу поліДМАЕМ та його комплексів із асОДН на рівень експресії фізіологічного пріона (PrPс) у клітинах лінії L1210 свідчать про зниження вмісту PrPс на 70-90%. Доведена можли- вість успішного застосування кон’югатів асОДН та носія для практично повного пригнічення експресії фізіологічного пріона у селезінці, тонкій кишці і, що найважливіше, мозку тварин. Таким чином, перспективним є те, що наносполуки здатні долати гематоенцефалічний бар’єр і впливати на патологічний процес у мозку. Досягнення нанотехнології в розробленні вакцин полягають у вико- ристанні нових ад’ювантів на основі наночастинок, до яких кріпляться безпечні антигени, що утворюються з синтетичних пептидів і рекомбі- нантних білків. Такі вакцини матимуть значно більший ефект, не чини- тимуть побічних дій та будуть безпечними при застосуванні. Проведені в ІБТ НААН дослідження показали, що новий тип нанопо- лімерів на основі псевдоамінокислот поліестерного типу не є шкідливи- ми для організму і вони можуть бути використані як ад’юванти в процесі створення вакцин. У характеристиці наноматеріалів особливо важливими є розчин- ність, розмір частинок, а також проникність через біологічні мембрани. 140 Ці властивості можуть бути взаємопов’язані, що вимагає поєднання різ- них наукових напрямів і підходів у їх дослідженні. Так, розчинність нано- розмірної речовини буде впливати на вибір складу препарату та аналі- тичного методу дослідження. Розмір частинок також повинен бути оп- тимальним, оскільки зменшення величини частинок має свої межі не тільки з точки зору технології, але й з точки зору біодоступності та без- печності. Не можна вважати виправданим бажання отримати якомога менший розмір частинок речовини, оскільки зменшення розміру части- нок може викликати інактивацію речовини, швидке виведення з органі- зму або прояв небажаної дії на організм. Одна з важливих властивостей наночастинок – здатність виступати переносником фізіологічно активних речовин, ксенобіотиків та лікарських засобів у клітинимішені як основи розвитку патологічного процесу. В ролі наночастинок, які стають своєрідними «кур’єрами» або «контейнерами», можуть бути використані наночіпи – фосфоліпідні частинки, ліпосоми, фу- лерени, дендримери, хітозан, нанотрубки та інші. Наноструктуризація при- зводить до зменшення розміру лікарської форми і підвищення вмісту аки- вної речовини у крові. Є два напрями адресної доставки ліків: пасивний на- правлений транспорт (полегшене подолання природних бар’єрів) та спе- цифічна доставка (впізнавання патологічної тканини). Так, українськими дослідниками доведена можливість трансмембранного транспортування нанорозмірних комплексів і частинок у клітини бактерій, що здатні до ви- біркового акумулювання колоїдних частинок Ауруму, а також визначено молекулярні структури і механізми, відповідальні за цей процес. З цього напряму досліджень розроблені нові методи і засоби на на- нометровому рівні, які починають застосовуватися у медико-біологічній практиці. Зокрема прицільна протипухлинна терапія за щоденного клі- нічного використання має такі переваги: надає можливість молекуляр- ного відображення найменших проявів дії наночастинок на клітинному рівні; формує ефективний механізм молекулярного прицілювання після ідентифікації певних клітинних маркерів; дозволяє застосовувати тех- нологію знищення клітин, ідентифікованих як злоякісні, а також техно- логію моніторингу одержаного ефекту. Сучасний стан розвитку нанотех- нологій дозволяє усувати дефекти в організмі хворої людини чи тварин 141 способом керованих нанохірургічних втручань, створювати прилади для контролю рівня глюкози у крові та для виробництва інсуліну. Методами молекулярного моделювання продемонстровано можливість створення на порядок складніших систем, зокрема штучних еритроцитів. Упровадження нанотехнологічних підходів у практику дозволяє здійснювати ранню діагностику захворювань, виявляти онкологічні, ен- докринні, серцево-судинні захворювання, вірусні та бактеріальні інфек- ції, а також покращити ефективність діагностики, яке базується на пере- дачі візуальної інформації про найдрібніші структури – молекулярної фі- зіографії. Так, наночастинки Ауруму разом з антитілами можуть знизити шкідливий ефект від опромінення при лікуванні пухлин. Нанодіагностика in vitro розвивається у двох напрямках: викорис- тання наночастинок як маркерів біологічних молекул і застосування інноваційних нанотехнологічних способів вимірювання. Зокрема сенсо- рні системи, які вже зараз використовуються в біології, суттєво спрощу- ють діагностику захворювань та дозволяють простежувати взаємодію між протеїнами і ДНК в режимі реального часу. Оскільки в наш час стало принципово важливим «зчитування» генетичної інформації, за досить короткий час будуть створені та вдосконалені так звані ДНК-чіпи, які до- зволять високовірогідно здійснювати аналіз генетичної інформації лю- дини чи тварин і проводити лікувальний курс, який відповідає генетич- ному типу конкретної особини. Це зразу дозволить поставити завдання створення індивідуальних ліків. Завдяки нанотехнологіям отримала роз- виток тканинна імплантація у зв’язку з використанням інноваційних за- собів відновлення чи заміщення органів і тканин. Зокрема нанокристалі- чна структура поверхні імпланта прискорює процес остеогенезу і вклю- чення штучного матеріалу в природну кісткову тканину. Іншим методом є нанокристалічне алмазне покриття, яке також обіцяє значно подовжи- ти функціонування і стабільність імплантатів. Почав розвиватися напрямок дослідження біоматеріалів – наново- локон, котрі вчені хочуть використати для створення штучних тканин (у перспективі – органів) на основі клітинних технологій. Визначають та- кож інші пріоритетні напрями розвитку нанобіотехнології та отримання наноматеріалів: 142  супершвидкісні молекулярні детектори для визначення первинної структури генома на основі неорганічних нанопор;  геноми, що саморозмножуються і застосовуються з метою виробниц- тва ліків, проведення фармакологічного скрінінгу та моделювання патологічних процесів;  біосумісні наноматеріали широкого спектру застосування для ство- рення принципово нових типів перев’язувальних матеріалів і штуч- них органів. Розроблена методика відтворення хрящової тканини, що має меха- нічні та біохімічні властивості, близькі до природного хряща, і викорис- товується для відновлення фізичних властивостей зубної емалі; ство- рюються технології обробки поверхонь методом нанонапилення з метою надання їм антибактеріальних властивостей. Наночастинки Аргентуму проявляють антивірусні, антибактеріальні та ранозагоювальні ефекти. Нанодезінфектанти на основі наночастинок Аргентуму мають широкий спектр біоцидної і антивірусної активності та значно вищу токсичність стосовно мікробів, вірусів і грибків, зокрема до штамів, не сприйнятливих до традиційних антибіотиків, дезінфектантів та антисептиків. Наприклад, папір з нанесеними на нього наночастинками Аргентуму має згубні властивості для таких бактерій, як кишкова паличка. Завдяки новітнім технологіям отримання та нанесення наночастинок мо- жна досягти рівномірнішого їх розподілу по поверхні паперу та уникнути утворення агломератів, що призводить до збільшення ефективної поверхні Аргентуму за зовсім невеликої витрати металу. Нанесення наночастинок цього елементу на суль фаніламід (стрептоцид), який сам по собі має ши- рокий спектр протимікробної дії, модифікує наявний лікарський засіб та призводить до таких позитивних ефектів, як пролонгація та локалізація дії. В ІБТ НААН проведені комплексні дослідження стосовно впливу за- стосування функціоналізованих наночастинок Аргентуму в репродукти- вній біотехнології, зокрема при дозріванні ооцитів, зберіганні сперміїв та розвитку ембріонів за умов in vitro, а також при заплідненні та ранньому ембріональному розвитку кролів in vivo. Отримані дані мають важливе значення для створення лікарських препаратів на основі наночастинок 143 Ag з подальшим їх використанням у лікуванні інфекційних хвороб, зок- рема пов’язаних з репродуктивною системою. Сьогодні також проведені широкомасштабні дослідження з вивчен- ня біологічної дії нанопорошків Феруму. Було досліджено вплив наноча- стинок Феруму на організм мишей, щурів, великої рогатої худоби, птахів, риб і деякі рослинні об’єкти. Встановлено, що гостре пероральне введен- ня їх суспензії мишам в дозі 50, 100 і 500 мкг/кг не викликало жодних токсичних ефектів. Водночас введення доз 1000, 2000 і 5000 мкг/кг при- зводило до розвитку запального процесу на слизовій оболонці шлунка та кишечнику, а також порушення гемоцитопоезу. На основі отриманих ре- зультатів механізм токсичної дії наночастинок Феруму автори пов’язують зі стимуляцією оксидативного стресу, порушенням функцій мітохондрій і збільшенням проникності мембран клітин. Іншими авторами доведено, що однократне введення наночастинок ферум оксиду (Fe2O3) у концентрації 100 мкг/мл стимулювало дихальну функцію крові, змінювало геометричний профіль еритроцитів, індукувало конформаційну перебудову гемоглобіну. Слабка токсичність, біосумісність і магнітні властивості Феруму дозволили створити на основі Fe2O3 маркер для онкодіагностики, стабілізований декстраном і натрію цитратом. Останнім часом доведено, що зменшення розміру частинок призво- дить до якісних змін їх магнітних властивостей, що є основою однодо- менного стану та суперпарамагнетизму. Відомо, що наночастинки на ос- нові оксигідроксидів Феруму у вигляді феритину утворюються в органі- змі. Доведено також біологічну безпечність штучно створених наночас- тинок ферум оксиду. Це дало підставу саме на основі названих магнітних наноматеріалів провести дослідження і рекомендувати розробки для за- стосування у біології та медицині. Спроби створити наноматеріали з кращими магнітними властивостя- ми, ніж у наночастинок ферум оксиду, призвели до синтезу композитних наночастинок, зокрема MnFe2O4. Зазначені наночастинки перевершили на- ночастинки ферум оксиду в ролі контрастних агентів для магнітно-ре- зонансної томографії за проведених досліджень in vivo. Композити наноча- стинок ферум оксиду із приєднаними атомами тербію не були цитотоксич- ними, а крім магнітних, демонстрували також флуоресцентні властивості. 144 Окрім діагностичних застосувань, композитні нанокристали на ос- нові Феруму можуть використовуватися і для лікування злоякісних но- воутворень. Однак майбутнє нанобіотехнологій не за наночастинками, а за фун- кціональними нанобіоматеріалами, в яких наявність вільних (незв’язаних) наночастинок зведена до мінімуму, а найкраще – до нуля. З цієї причини перспективними нанопродуктами є функціональні нанобі- оматеріали у вигляді наноаквахелатів різних металів, які проявляють високу біологічну активність і не є токсичними. Завдяки розробці еро- зійновибухових нанотехнологій отримані нові наноматеріали. Зокрема, за методом Косінова Каплуненка отримані колоїдні розчини наночасти- нок металів; аквахелати та гідратовані наночастинки біогенних металів; електрично нейтральні і електрично заряджені металеві наночастинки макро-мікроелементів в аморфному стані. За умов in vitro проведено оцінку біологічної активності цитратів металів (Fe, Cu, Zn, Mg), отриманих ерозійно вибуховою нанотехнологією, з розміром частинок не більше 200 нм. Досліджено їхній вплив на куль- тури клітин людини НерG2 (гепатокарцинома), A549 (недрібноклітин- ний рак легень), HaCat (нормальні кератиноцити) та на білки сироватки крові людини (альбуміни, імуноглобуліни). Встановлено, що найбільшу цитотоксичну активність стосовно культури клітин проявляли наночас- тинки Купруму та Цинку, найменшу – Магнію. Найбільша денатуруюча активність стосовно білків плазми крові людини визначена для наночас- тинок Феруму, а найменша – для Магнію. Отримані результати дослі- джень вказують на те, що цитотоксична та денатуруюча активність од- ного й того ж металу була різною, що може вказувати на різні мішені їх- ньої токсичної дії. В ІБТ НААН виконуються комплексні дослідження щодо з’ясування фізіолого-біохімічних механізмів дії наноаквацитратів есенціальних мік- роелементів в організмі лабораторних і сільськогосподарських тварин у різні періоди онтогенетичного розвитку та продуктивного використан- ня. Розробляються і створюються біоактивні кормові добавки на основі нанокомпонентів у вигляді наноаквацитратів металів, що проявляють високу біологічну активність і не є токсичними. 145 Дослідженнями встановлено, що наноаквацитрати мінеральних елементів є біологічно ефективними і безпечними для здоров’я та до- зволені для збагачення кормів, сировини і харчових продуктів. Так, за використання цитратів Cr, Se та Ge для підгодівлі бджіл виявили зни- ження вмісту важких металів (Сd, Pb) як у тканинах цілого організму, так і окремих анатомічних відділах бджіл. Виявлено позитивні зміни динамі- ки вмісту окремих фракцій ліпідів, що сприяють процесам метаболічного нагромадження енергетичних і пластичних компонентів трофічного ла- нцюга та підтверджують доцільність використання цитратних добавок у підгодівлі бджіл. Отже, нанотехнології є мультидисциплінарним напрямом фундаме- нтальної та прикладної науки з широким спектром різноманітних засо- бів та інструментів на стику біології, фізики, хімії та інженерії. Нанотех- нології є одним з найважливіших напрямів у біологічній науці, гуманній і ветеринарній медицині, сучасному сільському господарстві, а також хар- човій промисловості, що може стати рушійною економічною силою в найближчому майбутньому. КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ 1. Що таке нанонаука, нанобіотехнологія? 2. Назвіть основні напрямки нанонауки. 3. Пригадайте історію виникення нанотехнологій. 4. Які основні види синтетичних наноматеріалів ви знаєте? 5. Які переваги нанопрепаратів, що розробляються в наномедицині пе- ред традиційними? 6. Назвіть основні напрямки розвитку нанобіотехнологій. 7. Опишіть розвиток нанобіотехнологій в Україні. 146 СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 1. Біотехнологія: підручник / ред. В.Г., Герасименко. Київ: Інкос, 2006. 2. Влізло В.В., Іскра Р.Я., Федорук Р.С. Нанобіотехнології. сучасність та перспективи розвитку. Біологія тварин. 2015. Вип. 7 (4). С. 18-29. 3. Каратєєва О.І., Юлевич О.І. Загальна біотехнологія: курс лекцій. Миколаїв: МНАУ, 2022. 4. Молекулярна генетика та технології дослідження геному: навч. посіб. / ред. М.І. Гиль. Миколаїв: МНАУ, 2014. 5. Пляцук Л.Д. Екологічна біотехнологія: принципи створення біотехнологічних ви- робництв: навчальний посібник. Суми: Сумський державний університет, 2018. 6. Сиволоб А.В. Молекулярна біологія: підручник. Київ: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2008. 147 Міністерство освіти і науки України Кам’янець-Подільський національний університет імені Івана Огієнка НАВЧАЛЬНЕ ЕЛЕКТРОННЕ ВИДАННЯ ГРИГОРЧУК Інна Дмитрівна, кандидат біологічних наук, доцент кафедри біології та екології Кам’янець-Подільського національного університету імені Івана Огієнка ОПТАСЮК Ольга Михайлівна, кандидат біологічних наук, доцент кафедри біології та екології Кам’янець-Подільського національного університету імені Івана Огієнка БІОТЕХНОЛОГІЯ З ОСНОВАМИ НАНОТЕХНОЛОГІЇ КУРС ЛЕКЦІЙ НАВЧАЛЬНО-МЕТОДИЧНИЙ ПОСІБНИК ЕЛЕКТРОННЕ ВИДАННЯ Підписано 26.03.2024. Формат 60х84/16. Гарнітура «Cambria». Об’єм даних 2 Мб. Обл.-вид. арк. 6,9. Зам. № 1096. Кам’янець-Подільський національний університет імені Івана Огієнка, вул. Огієнка, 61, м. Кам’янець-Подільський, 32300. Свідоцтво серії ДК № 3382 від 05.02.2009 р. Виготовлено в Кам’янець-Подільському національному університеті імені Івана Огієнка, вул. Огієнка, 61, м. Кам’янець-Подільський, 32300.